免疫組化Immunohistochemistry

一、概述
1、定義
用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。
2、原理
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。
3、分類
1）按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。
2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。

 3）按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。
4、實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。
5、實(shí)驗(yàn)所用抗體
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

二、免疫染色
下面以石蠟切片的免疫組化為例演示詳細(xì)操作流程（SP法）:
1.60℃烤片2小時(shí)
2.脫蠟。二甲苯脫蠟15分鐘，三次
3.水化。依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分鐘，蒸餾水（或自來(lái)水）5分鐘
4.PBS（洗液C-0079）洗5分鐘，三次
5.抗原修復(fù)。枸櫞酸緩沖液（修復(fù)液，C-0070）（約92-95℃）煮沸（沸水浴）修復(fù)15分鐘，自然涼至室溫。PBS洗5分鐘，三次
6.3%雙氧水（包含在SP-0023中）消化內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶，20分鐘，PBS洗5分鐘，三次
7.正常山羊血清（包含在SP-0023中）封閉，37℃20分鐘
8.一抗孵育，4℃過(guò)夜. （抗體稀釋液C-0007）
9.PBS洗5分鐘，三次
10.二抗孵育，37℃20分鐘（二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，包含在SP-0023中），PBS洗5分鐘，三次
11.三抗孵育，37℃20分鐘（三抗為辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素，包含在SP-0023中），PBS洗5分鐘，三次
12.DAB（顯色劑C-0010）顯色，鏡下觀察結(jié)果，適時(shí)終止
13.蘇木素（C-0021）復(fù)染5分鐘，自來(lái)水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精（75%）溶液（此試劑無(wú)法銷售，請(qǐng)自行配置，配制比例為：100ml 75%酒精+1ml濃鹽酸）分化30秒，自來(lái)水沖洗5分鐘藍(lán)化
14.脫水。依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇，各5分鐘，二甲苯15分鐘，三次
15.封片，中性樹(shù)膠（C-0073）封片

三、有關(guān)免疫組化實(shí)驗(yàn)的重要問(wèn)題
（一）組織材料處理
1.取材要取新鮮組織，大小合適，用生理鹽水洗凈
2.固定固定就是把病理標(biāo)本組織浸泡在固定液中（常用的有4%多聚甲醛），使組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝聚、沉淀或變性成為不溶性物質(zhì)，并保持細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)
3.洗滌固定后一定要把滲透到組織里面的固定液洗去，以利于進(jìn)行脫水，若組織中留有較多的固定液，則將影響脫水劑，甚至可在組織中發(fā)生沉淀而影響后續(xù)染色及觀察，對(duì)于陳舊性標(biāo)本或固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的標(biāo)本，更應(yīng)注意流水沖洗。
4.脫水脫水必須徹底，若脫水不盡，則切片后組織與空氣接觸即干燥收縮，蠟塊切面出現(xiàn)凹陷現(xiàn)象，雖可勉強(qiáng)切片，但染色效果差，染色時(shí)也容易脫落
5.透明乙醇等脫水劑不能溶解石蠟，所以浸蠟之前需要一個(gè)既能與乙醇混合又能溶解石蠟的媒劑，以便使石蠟浸入到組織中去，當(dāng)組織中全部被透明劑占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，此現(xiàn)象稱為透明。如果組織不能透明，表明脫水未盡必須重新返工，否則影響到浸蠟的進(jìn)行，但返工時(shí)往往效果不好
6.浸蠟浸蠟時(shí)間根據(jù)組織的類型可適當(dāng)調(diào)整，一般原則較小組織脫水時(shí)間和浸蠟時(shí)間較短；骨、肌肉等堅(jiān)硬組織脫水和浸蠟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)；脂肪組織、疏松結(jié)締組織脫水和浸蠟時(shí)間需增加
7.包埋包埋時(shí)應(yīng)注意組織的包埋方向，否則將影響組織切片的形態(tài)。包埋用的石蠟要和浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)一致，包埋用的石蠟溫度要稍高于浸蠟的溫度。包埋好后可置于冷水中使石蠟迅速冷凝。包埋好的石蠟塊應(yīng)呈均勻的半透明狀，如出現(xiàn)白色渾濁則其中存在石蠟的結(jié)晶，這種蠟塊不能切除薄的切片。可能是組織脫水不充分，組織內(nèi)或石蠟中混有透明劑，或包埋時(shí)動(dòng)作太慢或石蠟?zāi)�固太慢所致，所以冷卻時(shí)水溫不能過(guò)高，否則就不宜迅速凝固
8.切片可以將制作好的蠟塊置于低溫環(huán)境預(yù)冷，切出的切片連續(xù)性較好，有利于展片，一般切片厚度4-6um
（二）抗原修復(fù)
組織在制作過(guò)程中，由于固定液的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過(guò)程中不能將其顯示出來(lái)，為了解決上述的問(wèn)題，利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來(lái)或修正過(guò)來(lái)的過(guò)程稱為抗原修復(fù)。
北京博奧森常用的抗原修復(fù)液有：0.01M枸櫞酸（pH6.0）、0.05M EDTA（pH8.0）、0.01M TBS（pH7.4）、胃蛋白酶、胰蛋白酶
北京博奧森常用的抗原修復(fù)方法：
方法1：沸水浴修復(fù)，將盛有修復(fù)液和玻片的燒杯置于沸水浴環(huán)境，保持外部沸騰狀態(tài)15min，自然冷卻至室溫。
方法2：微波修復(fù)，將盛有修復(fù)液和玻片的燒杯置于微波爐中，高火5min，�；�3min，中火5min，自然冷卻至室溫。
方法3：高壓修復(fù)，修復(fù)液加入高壓鍋加熱至沸騰，放入玻片，封蓋加壓持續(xù)加熱至噴氣時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)修復(fù)2min，自然冷卻至室溫。
方法4：使用胃蛋白酶修復(fù)，將胃蛋白酶修復(fù)液加入到組織上，37℃，消化30min

抗原修復(fù)，必須注意以下問(wèn)題：
1、修復(fù)液的選擇。
0.01M枸櫞酸（pH6.0）：應(yīng)用最多的抗原修復(fù)液，適用于大多數(shù)的抗原，用該液修復(fù)后的抗原表達(dá)增強(qiáng)，抗原的定性和定位很理想，結(jié)果不錯(cuò);
0.05M EDTA（pH8.0）：應(yīng)用較多的抗原修復(fù)液，修復(fù)能力較強(qiáng)，對(duì)于保存時(shí)間較長(zhǎng)的切片或目的蛋白表達(dá)較弱的組織有很好的修復(fù)效果，需要控制好修復(fù)時(shí)間，否則容易出現(xiàn)較重的背景;
0.01M TBS（pH7.4）：中性修復(fù)液，適用于大多數(shù)抗原，對(duì)于核定位蛋白有較好的修復(fù)效果;
胃蛋白酶：應(yīng)用較多的抗原修復(fù)液，適用于大多數(shù)的抗原，使用溫度37℃，對(duì)于容易脫片的切片有很好的保護(hù)作用。
胰蛋白酶：應(yīng)用較多的抗原修復(fù)液，適用于大多數(shù)的抗原
2.抗原熱修復(fù)時(shí)應(yīng)選擇最佳溫度。
據(jù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因?yàn)椋海?）這種溫度未達(dá)沸騰，切片不容易脫離載玻片；（2）能夠解離和破壞與蛋白交聯(lián)的甲醛醛鍵等，處理時(shí)可以隨意選擇和確定抗原修復(fù)的作用時(shí)間。如果選擇高壓修復(fù)，因?yàn)闇囟容^高，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)
3.抗原修復(fù)時(shí)有效溫度所需持續(xù)時(shí)間根據(jù)各單位的設(shè)備條件以及使用的儀器不同，抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間也不一樣。
4.抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的。
5.盡量使用足量的抗原修復(fù)液，防止切片干涸。
6.切片必須附貼牢固，否則發(fā)生掉片。

（三）合適的抗體稀釋度
抗體的濃度是免疫染色的關(guān)鍵，如果抗體濃度過(guò)高，抗體分子過(guò)多于抗原決定簇，可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少，產(chǎn)生陰性結(jié)果。此陰性結(jié)果并不一定是缺少抗原，而是由于抗體過(guò)量，這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶效應(yīng)（prozone effect）。因此，必須使用一系列稀釋做“棋盤式效價(jià)滴定”，檢測(cè)抗體的合適稀釋度，以得到最大強(qiáng)度的特異性染色和最弱的背景染色�？贵w稀釋度應(yīng)根據(jù)：1.抗體效價(jià)高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；2.一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時(shí)間越長(zhǎng)；3.對(duì)于抗體與非特異性蛋白的結(jié)合，只有高稀釋度時(shí)才能防止其非特異性背景染色；4.稀釋用緩沖液的種類，標(biāo)本的固定和處理過(guò)程等也可影響稀釋度，所以合適的稀釋度應(yīng)根據(jù)具體情況測(cè)定。抗體的稀釋主要是指第一抗體，因?yàn)榈谝豢贵w中特異性抗體合適的濃度是關(guān)鍵，應(yīng)用高稀釋度第一抗體僅高親和力的特異性染色反應(yīng)，減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。
（四）血清封閉，減少非特異性結(jié)合
組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱為非特異性背景染色，最常見(jiàn)的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加與制備第二抗體相同動(dòng)物的非免疫血清（1:5-1:20），封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與一抗非特異性結(jié)合。必要時(shí)加入2%-5%牛血清白蛋白，可進(jìn)一步減少非特異性染色，作用時(shí)間為10-20min。免疫熒光染色時(shí)，可用0.01%伊文藍(lán)（PBS溶液）稀釋熒光抗體，對(duì)消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。洗滌用的緩沖液中加入0.85%-1%NaCl成為高鹽溶液，充分洗滌切片，能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。

（五）設(shè)置對(duì)照
其目的在于證明和肯定陽(yáng)性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問(wèn)。主要是針對(duì)第一抗體對(duì)照，常用的對(duì)照方法包括：1. 陽(yáng)性對(duì)照；2. 陰性對(duì)照；3. 阻斷實(shí)驗(yàn)； 4.替代對(duì)照；5. 空白對(duì)照；6. 自身對(duì)照；7. 吸收實(shí)驗(yàn).
1. 陽(yáng)性對(duì)照用已知抗原陽(yáng)性的切片作對(duì)照與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)照切片應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，成為陽(yáng)性對(duì)照。證明全過(guò)程均符合要求，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照尤為重要。
2.陰性對(duì)照用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，成為陰性對(duì)照，是陰性對(duì)照的一種。其實(shí)空白、替代、吸收和抑制都屬于陰性對(duì)照。當(dāng)待檢標(biāo)本呈陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，陰性對(duì)照就更加重要，用以排除假陽(yáng)性。
（五）顯色觀察
免疫酶染色應(yīng)注意控制：
1. 呈色質(zhì)濃度和反應(yīng)時(shí)間。增加成色質(zhì)的量和（或）增加底物反應(yīng)時(shí)間，可增加反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度；著色太深可減少反應(yīng)時(shí)間。
2. 過(guò)氧化物酶顯色時(shí)，H2O2濃度較大將使顯色反應(yīng)過(guò)快而至背景加深；過(guò)量H2O2可能抑制酶的活性。
（六）免疫組化結(jié)果的判斷
對(duì)免疫組化結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)的慎重態(tài)度，要準(zhǔn)確判斷陽(yáng)性和陰性，排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，必須嚴(yán)格對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)新發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果，除有對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果之外，應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可用幾種方法進(jìn)行驗(yàn)證。必須學(xué)會(huì)判斷特異性染色和非特異性染色，對(duì)初學(xué)者更為重要，否則會(huì)得出不科學(xué)的結(jié)論。特異性染色和非特異性染色的鑒別點(diǎn)主要在于特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定的部位。如胞漿內(nèi)，也有分布在細(xì)胞核和細(xì)胞表面的，即具有結(jié)構(gòu)性。特異性染色表現(xiàn)為在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性染色結(jié)果。非特異性染色表現(xiàn)為無(wú)一定的分布規(guī)律，常呈某一部位成片的均勻著色，細(xì)胞和周圍的結(jié)締組織均無(wú)區(qū)別的著色，或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強(qiáng)的染色。非特異性染色常出現(xiàn)在干燥切片的邊緣，有刀痕或者折疊的部位。在過(guò)大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性染色。有時(shí)可見(jiàn)非特異性染色和特異性染色同時(shí)存在，由于過(guò)強(qiáng)的非特異性染色背景不但影響對(duì)特異性染色結(jié)果的觀察和記錄，而且令人對(duì)其特異性結(jié)果產(chǎn)生懷疑。
免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。
1.陽(yáng)性細(xì)胞染色分布有三種類型：細(xì)胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面。大部分抗原見(jiàn)于細(xì)胞漿，可見(jiàn)于整個(gè)胞漿或部分胞漿
2.陽(yáng)性細(xì)胞分布可分為灶型和彌漫性
3.由于細(xì)胞內(nèi)含抗原量不同，所以染色強(qiáng)度不一。如果細(xì)胞之間染色強(qiáng)度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性
4.陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于單個(gè)細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞。
5.切片邊緣、刀痕或褶皺區(qū)域，壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)，膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽(yáng)性染色強(qiáng)度，不能用于判斷陽(yáng)性。
（七）染色失敗的幾種原因
1.所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)，全部呈陰性反應(yīng)，原因可能是：（1）染色未按嚴(yán)格操作步驟進(jìn)行；（2）漏加一種抗體，或抗體失效；（3）緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；（4）底物中所加H2O2量少或失效；復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)。
2.所有切片均呈弱陽(yáng)性反應(yīng)：（1）切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃，或干燥了；（2）緩沖液配制中未加氯化鈉或pH不準(zhǔn)確，洗滌不徹底；（3）使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；（4）抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；（5）H2O2濃度過(guò)高，呈色速度過(guò)快；（6）粘附劑太厚。
3.所有切片背景過(guò)深：（1）未用酶消化處理切片；（2）切片或涂片過(guò)厚；（3）漂洗不夠；（4）底物呈色反應(yīng)過(guò)久；（5）蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血；（6）使用全血清抗體稀釋不夠。
4.陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)，固定和處理不當(dāng)是最常見(jiàn)的原因。對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的定量判斷，常規(guī)方法是根據(jù)呈色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分類計(jì)數(shù)，以（-）、+、++、+++等分級(jí)和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。