最初養(yǎng)細胞的時候看著師兄全副武裝進入細胞房是一件很神圣的事情。。。
時間長了才發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)細胞是一件痛苦并快樂的事情，要像對待小baby一樣照顧它、呵護它，細胞長的好心情就會像飛起來，細胞出現(xiàn)一點點狀況，心情就會跌入谷底。下面將小編多年養(yǎng)細胞的經(jīng)驗、心得與注意事項與大家交流一下。
一般來說，影響細胞培養(yǎng)的因素有很多，下面我們分為幾個小專題和大家分享一下。
1.血清篇2.添加劑篇3.細胞傳代篇
4.細胞凍存篇5.細胞污染篇6.原代細胞篇
血清篇
血清的熱滅活：
滅活方法：56℃滅活30min。滅活后，血清的外觀會發(fā)生變化，沉淀物顯著增多。熱滅活主要是滅活補體系統(tǒng)，因為激活的補體系統(tǒng)會激活淋巴細胞和巨噬細胞。原代細胞和免疫細胞建議熱滅活血清。
血清的沉淀：
血清沉淀主要是血清中的各種蛋白、磷酸鈣和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白、玻連蛋白等）引起，不會影響血清質(zhì)量，使用時可以2000rpm
離心5分鐘，取上清使用。
可能會增加血清沉淀的操作：1、熱滅活；2、37℃培養(yǎng)；3、反復(fù)凍融；4、伽馬射線照射；5、2-8℃長期保存；6、長期保存于可自動化霜的冰箱中（溫度不穩(wěn)定）。
血清保存：
建議血清保存于-20℃冰箱中，分裝使用，如果存放在4℃，請勿超過一個月。
血清的選擇：
血清為細胞的繁殖提供必須的生長因子，同時也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細胞系和克隆化培養(yǎng)。 血清批次間的差別是不可避免的，建議您一旦選定了某個批次的血清，最好備貨，避免以后的麻煩。
添加劑篇
平衡鹽溶液
平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成；它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)；同時用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。
PBS磷酸鹽緩沖液： (Phosphate-Buffered Saline)，含135mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4，pH值為7.4，經(jīng)過滅菌處理。
用途：用于細胞培養(yǎng)過程中細胞的洗滌或其他常規(guī)用途。
D-PBS：D-PBS溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，含2.67mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 137.93mM NaCl, 8.06mM Na2HPO4，pH值為7.4，經(jīng)過滅菌處理。
用途：不含鈣、鎂離子，多用于胚胎學(xué)方面的研究，常用于胚胎的沖洗液，凍存液和培養(yǎng)液。
Hank’s平衡鹽：Hanks' Balanced Salt Solution，簡稱HBSS，含137.93mM NaCl, 5.33mM KCl, 4.17mM NaHCO3, 0.441mM KH2PO4, 0.338mM Na2HPO4, 5.56mM D-Glucose。經(jīng)過無菌處理。
用途：可用于在大氣環(huán)境下維持細胞生理 pH 的緩沖液，用于細胞培養(yǎng)過程中細胞的洗滌等常規(guī)用途。
緩沖液
絕大多數(shù)細胞的最佳生長條件是pH 6.8-7.8。多數(shù)培養(yǎng)基利用碳酸氫鈉進行緩沖，碳酸氫鈉的緩沖需要二氧化碳。 NaHCO3溶液：7.5% NaHCO3溶液(Sodium Bicarbonate Solutioin)用水配制，已經(jīng)過過濾除菌。
用途：常用于細胞培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。
細胞傳代篇
胰酶消化細胞：
a.吸去培養(yǎng)液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清。
b.加入少量胰酶細胞消化液，略蓋過細胞即可，室溫放置30秒至2分鐘。不同的細胞消化時間有所不同。
c.顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化；或者用槍吹打細胞發(fā)現(xiàn)細胞剛好可以被吹打下來。此時吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的完全細胞培養(yǎng)液，吹打下細胞，即可直接用于后續(xù)實驗。
d.如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細胞消化液重新消化。
如果發(fā)現(xiàn)細胞消化時間過長，未及吹打細胞，細胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細胞消化液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細胞，即可用于后續(xù)實驗。
對于比較難消化的細胞，比如結(jié)腸癌細胞HCT116，HCT15，KM12，這些細胞一般需要少量的胰酶孵育，以恰好覆蓋細胞為宜，時間在5min左右，細胞呈流沙狀移動，即可終止消化。對于難消化的細胞，一般在trypsin中添加一些EDTA。
細胞凍存篇
細胞凍存遵守慢凍速融原則。細胞在凍存時，細胞冷到0℃以下，細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞中形成冰晶，大的冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂，因此需要慢凍，防止大的冰晶產(chǎn)生；快融是防止小冰晶重結(jié)晶形成大冰晶。常用的低溫保護劑是DMSO，是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，使水滲透到細胞外形成冰晶。細胞凍存液主要成分是高糖DMEM、適量澳洲進口優(yōu)質(zhì)胎牛血清及DMSO。
細胞凍存步驟：胰酶消化細胞--吹打成細胞懸液--離心獲取細胞沉淀--添加凍存液--程序性降溫凍存細胞--做好凍存記錄。
注意事項：1、0至-60℃是低溫損傷發(fā)生的主要溫度范圍，被稱為“危險溫區(qū)”，細胞短暫放置后應(yīng)立刻轉(zhuǎn)移到-80℃，長期保存需要轉(zhuǎn)移到液氮罐中，并定期檢查液氮罐，及時添加。
細胞污染篇
養(yǎng)細胞最頭痛的就是遇到污染問題，總是讓你猝不及防，又無從尋找原因�，F(xiàn)整理一些細胞培養(yǎng)過程中常遇見的污染問題，供君參考。
細胞污染根據(jù)污染源的不同主要分為3類：化學(xué)性污染、物理性污染和微生物污染，其中微生物污染是最常見也是最嚴重的，一旦發(fā)生，無法挽救，只能將細胞丟棄。下面簡單介紹一下常見的微生物污染。
霉菌污染：霉菌污染種類很多，多為曲霉菌、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
污染源：實驗人員（實驗服）
霉菌污染后短期內(nèi)不會引起培養(yǎng)液的渾濁，會在培養(yǎng)液中形成白色或淡黃色漂浮物，一般肉眼可見，易被發(fā)現(xiàn)。4d左右倒置顯微鏡下可以觀察到縱橫交錯的菌絲。
酵母污染更容易觀察，培養(yǎng)物變渾濁，顯微鏡下可以觀察到卵圓形或球形顆粒，散在細胞上及細胞周邊生長，有些會芽生較小顆粒。
確認是霉菌污染后，需要將細胞直接丟棄，將實驗環(huán)節(jié)徹底消毒處理。
細菌污染：
常見的細菌污染主要是大腸桿菌、假單胞菌、 葡萄球菌等，其中革蘭陽性菌較為多見。
污染源：操作不當或是器材消毒不嚴，或是各種營養(yǎng)成分隱性污染細菌沒有被檢測出來所造成的。
污染速度快，多數(shù)情況下細胞培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，pH值降低，明顯渾濁，倒置顯微鏡下觀察，細胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，細胞培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細沙狀，細胞間可以觀察到菌體存在。必要時可以取少量培養(yǎng)液接種到細菌培養(yǎng)板或細菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)、檢測。一旦發(fā)生細菌污染，早期時可以增大雙抗的使用倍數(shù)，用藥24-48小時后更換成常規(guī)培養(yǎng)基，污染晚期，細胞需要棄掉，復(fù)蘇新的細胞。
支原體污染：
污染源：血清
大小介于細菌與病毒之間的無細胞壁的原核細胞，對抗生素不敏感，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜，不能用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測，在細胞培養(yǎng)過程中是最容易忽視的一類污染。
支原體污染早期，細胞沒有明顯的變化，只有污染嚴重后，細胞增殖速度降低，細胞脫落。并且支原體可以通過移液、傾倒液體時產(chǎn)生具有潛在感染力的飛沫和吸附的塵埃，沉積在物體表面，污染操作環(huán)境，引起交叉感染和再次污染。懷疑支原體污染，可以使用支原體檢測試劑盒進行檢測。
污染較輕時，使用支原體去除試劑盒進行處理
同時嚴格清理實驗操作環(huán)境。
ps:從外部獲取的細胞請記得要進行支原體污染檢測呦！
黑膠蟲污染：
黑膠蟲是學(xué)術(shù)界爭議比較大的一類污染，不能確定是生物還是非生物，可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播。
污染源：血清
開始污染時對細胞無影響，當達到一定數(shù)量時會抑制細胞生長，培養(yǎng)基沒有變化，顯微鏡下可以觀察到點狀或片狀游動小體。細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
病毒污染：
病毒污染不會影響細胞的傳代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。
污染源：動物血清或者細胞系，常見于雜交瘤細胞。
病毒污染極為隱蔽，很難檢測。細胞液沒有變化，大多數(shù)受病毒污染的細胞也不會產(chǎn)生形態(tài)變化及細胞病理現(xiàn)象，僅有少部分病毒會造成細胞變圓、腫脹，脫落。 懷疑發(fā)生病毒污染可以用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細胞株。
非同種細胞污染：
即細胞交叉污染，由于在培養(yǎng)過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。細胞發(fā)生交叉污染后由于難以分離細胞，所以一般是丟棄細胞，重新獲取實驗所需細胞。 所以在吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。
原代細胞篇
注意事項：
原代細胞是剛從體內(nèi)取出的組織中獲得的細胞，要求不嚴格的話，十代以內(nèi)都算原代細胞。因為離體時間短更能接近體內(nèi)狀況，同時對體外培養(yǎng)條件更加苛刻，需要更接近體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)條件。
1、計數(shù)前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞，每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。
2、原代細胞未經(jīng)永生化處理，因此群體倍增次數(shù)有限。為了防止遺傳上的變化，最好盡快開始做實驗。另外，為了防止混入雜細胞比例的增加，要經(jīng)常觀察細胞形態(tài)。
3、原代細胞再凍存后，細胞會老化，也可能引起機能變化，所以不建議凍存。細胞凍存也是細胞死傷的主要原因。
4、如果DMSO的濃度足夠低，不會對細胞造成傷害，復(fù)蘇原代細胞建議用帶有血清的完全培養(yǎng)基溶解后鋪瓶，第二天換液去除DMSO。
5、原代細胞傳代時，要用低濃度的胰酶消化，在顯微鏡下看到細胞開始變圓、脫落后迅速終止胰酶。建議采用含10%血清的完全培養(yǎng)基作為胰酶終止劑終止消化。
