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發(fā)布時間:2024/10/18 8:37:15 閱讀次數(shù):230
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:豬丹毒桿菌熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)
英文名稱:Swine Erysipelas Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 50T/盒
【預(yù)期用途】
豬丹毒是紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae), 俗稱豬丹毒桿菌引起的一種急性熱性傳染病,其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊(亞急性)、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎(慢性)。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,主要用于豬丹毒桿菌的定性篩查檢測。
【原 理】
本試劑盒針對豬丹毒桿菌基因設(shè)計特異性引物和分子信標(biāo)探針,在待檢樣本中含有豬丹毒桿菌DNA的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)熒光信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【試劑盒組成】
序號 | 組成 | 50T/盒 |
1 | 豬丹毒 PCR反應(yīng)液 | 1000 μL×1管 |
2 | 豬丹毒 陰性對照 | 40 μL×1管 |
3 | 豬丹毒 陽性對照 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 |
注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為含豬丹毒桿菌靶基因的質(zhì)粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 如使用原始標(biāo)本進行檢測。標(biāo)本(病人腦脊液、靜脈血、關(guān)節(jié)液;病畜靜脈血,乳汁;菌落,菌苔等)應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本。
2. 如需在增菌后進行PCR檢測,則應(yīng)使用選擇性增菌液對原始標(biāo)本進行增菌。
3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃~-80℃。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液(UNG酶及Taq酶) | 20 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。上海細胞庫
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR(PCR擴增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集豬丹毒桿菌熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃:2分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
PCR擴增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結(jié)束時采集熒光信號) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
+ | 標(biāo)本中檢出豬丹毒桿菌 |
- | 標(biāo)本中未檢出豬丹毒桿菌 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室,應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理;
2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理;
3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染;檢測結(jié)束后,應(yīng)立即對工作臺清潔;
4. 吸取反應(yīng)液時,應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡;上 PCR 儀前,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確;
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心;
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨存放;
7. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記;
8. 檢測過程中使用過的吸頭,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄;工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒;
9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用;并在有效期內(nèi)使用。
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