HL-60細(xì)胞背景簡介

HL-60細(xì)胞是通過白細(xì)胞分離術(shù)從一名患有急性早幼粒細(xì)胞白血病的 36 歲白人女性的外周血中分離出來的早幼粒細(xì)胞。 HL-60 自發(fā)分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸（PMA，TPA）、DMSO（1% to 1.5%）、放線菌素D和視黃酸可以促進分化。細(xì)胞表現(xiàn)出吞噬活性，并對趨化刺激有響應(yīng)。致癌基因myc表達陽性。HL-60人急性早幼粒白血病細(xì)胞系可用于免疫紊亂和免疫學(xué)研究。

HL60細(xì)胞屬于急髓白血病M3細(xì)胞株,穩(wěn)定表達t（15，17）染色體核型以及PML融合基因，細(xì)胞總體形態(tài)為圓形，細(xì)胞膜清晰，細(xì)胞質(zhì)呈多顆粒狀。

ATCC細(xì)胞庫HL-60細(xì)胞圖片

細(xì)胞庫HL-60細(xì)胞圖片

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)實驗準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭（白色0-10ul；黃色20-200ul；藍色100-1000ul）、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：IMDM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)條件

形態(tài)特征：淋巴母細(xì)胞樣，懸浮生長

培養(yǎng)基: 80%IMDM+20%FBS +PS

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃

傳代方法：1:2至1:4，每周 3次

凍存條件：無血清凍存液（或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配），液氮儲存

HL-60胞收貨注意事項

1.收貨時需鏡下拍照（看密度、狀態(tài)）

2.靜置后需鏡下拍照（看整體密度）

a.如密度50%以下，建議換液并豎瓶培養(yǎng)

b.如密度50%-80%，建議換液培養(yǎng)，隔天觀察密度

c.如密度90%，建議傳代

3.換液及傳代處理前，培養(yǎng)瓶豎著放置至少半小時（使細(xì)胞沉到瓶底）；收集上清，必須將瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基（70ml）全部收集！并用PBS（10ml）潤洗瓶底并收集!離心轉(zhuǎn)速為1000rpm，5min。

HL-60細(xì)胞養(yǎng)操作步驟

HL-60細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.將含有1 mLHL-60細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻；

2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后輕輕吹勻；

3.將所有HL-60細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）；

4.第二天換液并檢查HL-60細(xì)胞密度。

HL-60細(xì)胞傳代方法

如果HL-60細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

方法一：收集HL-60細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余HL-60細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

HL-60細(xì)胞凍存方法

待HL-60細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例

a.收集HL-60細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)HL-60細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

HL-60是⽬前已⽤于科學(xué)研究的⼈類⽩⾎病細(xì)胞系，最初是分離⾃⼀名36歲的⼈類⼥性急性早幼粒細(xì)胞⽩⾎病患者。

HL-60細(xì)胞應(yīng)用特性

HL-60細(xì)胞以懸浮培養(yǎng)的形式在含有營養(yǎng)和抗⽣素的培養(yǎng)基中持續(xù)增殖，倍增時間約為 36 ⾄ 48 ⼩時。HL-60 細(xì)胞表現(xiàn)出嗜中性早幼粒細(xì)胞（neutrophilic promyelocyticmorphology） 形態(tài)，隨后進⾏的評估則指出其出⾃成熟的急性⾻髓性⽩⾎病。HL-60細(xì)胞通過在細(xì)胞表⾯表達的轉(zhuǎn)鐵蛋⽩及胰島素受體進⾏增殖。如果從⽆⾎清培養(yǎng)基中除去轉(zhuǎn)鐵蛋⽩或胰島素受體其中⼀項， HL-60 細(xì)胞的增殖就會⽴即停⽌。通過⼆甲基亞砜或維A酸的化合物，可以誘導(dǎo)其分化為成熟的粒細(xì)胞;⽽⾻化三醇、佛波醇-12-⼗四烷醯-13-⼄酸酯及顆粒⽩⾎球-巨噬細(xì)胞集落刺激因⼦等的化合物，則可以分別誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣或嗜酸性粒細(xì)胞表型。

HL-60細(xì)胞系科研用途

HL-60細(xì)胞可以⽤作研究⽣理學(xué)、藥理學(xué)和病毒學(xué)因素對髓樣分化的影響。HL-60細(xì)胞模型已經(jīng)應(yīng)⽤于研究DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 IIα 和 IIβ 對細(xì)胞分化和凋亡的影響，并且特 別適⽤于介電泳研究。此外，研究⼈員已使⽤HL-60細(xì)胞來研究細(xì)胞內(nèi)的鈣是否在活性氧誘導(dǎo)的胱天蛋⽩酶激活中發(fā)揮到作⽤。HL-60細(xì)胞及衍⽣的分化細(xì)胞，它們的染⾊質(zhì)和基因表達譜研究是近年進⾏的研究。

如何養(yǎng)好HL-60細(xì)胞經(jīng)驗分享

1.細(xì)胞形態(tài)觀察。細(xì)胞膜是每天必須觀察的，看是否清晰, HL60細(xì)胞的死亡往往是從細(xì)胞膜的破裂開始的，早期的表現(xiàn)就是細(xì)胞膜某一點出現(xiàn)欠完整或者毛發(fā)影。

2.HL-60細(xì)胞在高密度下狀態(tài)比較好，細(xì)胞狀態(tài)好時會吸收一些細(xì)胞碎片；

3.低密度時細(xì)胞狀態(tài)很差，傳代比例要控制，當(dāng)培養(yǎng)密度達到1x106/mL左右時可傳代，細(xì)胞狀態(tài)不好時后面?zhèn)鞔�可以不用離心；

4.DMSO會對HL-60刺激分化，建議復(fù)蘇馬上離心去除DMSO；

5.懸浮細(xì)胞對血清要求高，選用優(yōu)質(zhì)血清培養(yǎng)；

6.培養(yǎng)過程中盡量不動或少動培養(yǎng)瓶。

7.HL60細(xì)胞往往會有"抱團" 現(xiàn)象，抱團生長或死亡，勤換液或傳代，盡量避免細(xì)胞抱團。

8.HL60細(xì)胞生長迅速，強烈建議用較大的培養(yǎng)瓶養(yǎng)，用小瓶養(yǎng)的話，換液不及時,很容易死亡。HL60細(xì)胞的生長速度一般為2天左右就需要傳代。

9.HL60細(xì)胞對胎牛血清高度依賴。培養(yǎng)液PH應(yīng)調(diào)為7.20-7.40之間。

10.防污染。HL60細(xì)胞生長迅速，較少發(fā)生污染，但常規(guī)措施應(yīng)該做好。比如無菌操作，酒精消毒等，培養(yǎng)瓶口建議過火，包括瓶蓋，應(yīng)過火4秒左右。

11.凍存。-20℃小時, -80℃過夜，液氮長期保存。強烈建議液氮長期保存，盡量不要在-80℃長期保存，死亡率很高。

12.復(fù)蘇。調(diào)節(jié)水浴箱溫度為42°C，并提前在試管內(nèi)放置10倍培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液溫度與室溫一致。1分鐘內(nèi)融化細(xì)胞（禁止搖晃凍存管），移取至試管內(nèi)，動作要輕，從試管管底開始慢慢，上提移液管，使細(xì)胞在培養(yǎng)液內(nèi)分布均勻，離心，洗2次。

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.HL-60細(xì)胞生長慢、狀態(tài)差怎么辦

當(dāng)細(xì)胞傳代后生長速度慢且狀態(tài)不佳時，可豎著培養(yǎng)直到培養(yǎng)基變黃，待細(xì)胞密度起來后，狀態(tài)會有所好轉(zhuǎn)。

同時，若HL-60細(xì)胞狀態(tài)很差，可采用半換液的方式：

以T25瓶子為例，瓶子里有5mL培養(yǎng)基，豎起瓶子靜置一段時間（豎瓶前拍拍瓶子，讓輕貼底部的細(xì)胞團浮起來），待細(xì)胞沉底（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況），小心吸出2.5mL的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000rpm 3~5min，用2.5mL新鮮培養(yǎng)基重懸后再放回原瓶。

2.HL-60細(xì)胞什么時候傳代

HL-60細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)，

3.HL-60細(xì)胞貼壁嗎

HL-60細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，不是貼壁細(xì)胞。

4.HL-60細(xì)胞用什么培養(yǎng)基

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)基是80%IMDM+20%FBS +PS

5.HL-60細(xì)胞致瘤嗎

Yes, in nude mice（subcutaneous myeloid tumors） .Yes，in semi-solid media。

6.HL-60細(xì)胞受體表達情況

complement, expressed;Fc, expressed。

7.HL-60細(xì)胞基因表達情況

tumor necrosis factor （TNF），also known as tumor necrosis factor alpha（TNF-alpha, TNF alpha），after stimulation with phorbol myristic acid, myc+。

8.HL-60細(xì)胞的推薦接種密度是多少

ATCC 建議在補充有 20% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清的 IMDM中以 1.0-2.0 x 10 5 個活細(xì)胞/ml 的密度接種。這些細(xì)胞通常會從冷凍保存中緩慢恢復(fù)并作為單細(xì)胞懸浮液生長。HL-60細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中生長良好，只需每 2 或 3 天培養(yǎng)瓶中添加一些新鮮培養(yǎng)基即可。應(yīng)經(jīng)常進行細(xì)胞計數(shù)，以確保細(xì)胞密度不超過 1 X 10 6 個細(xì)胞/ml。