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發(fā)布時間：2020/11/9 13:52:08 閱讀次數(shù)：2230
Bend.3小鼠腦微血管內皮細胞培養(yǎng)說明書
一 細胞培養(yǎng)條件
| 中文名稱 | 小鼠腦微血管內皮細胞 | 英文名稱 | Bend.3 |
| 生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液 |
| 培養(yǎng)體系 | DMEM+10%FBS | ||
| 傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
| 備注 | 用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基,留作過渡培養(yǎng) | ||
二 細胞收到后處理
細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是細胞運輸?shù)淖詈棉k法.收到細胞回到自己的實驗室后,先打開外包裝,用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內,嚴格無菌操作,培養(yǎng)箱靜置2-4小時.鏡下觀察：未超過80%匯合度時,可將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,加入6ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時,根據(jù)情況傳代或者凍存,具體操作見細胞培養(yǎng)步驟.（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
三 細胞培養(yǎng)步驟
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5mL培養(yǎng)基混合均勻.在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻.然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中）,培養(yǎng)過夜.第二天換液并檢查細胞密度.
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng).
1 對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次.
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化.
3.輕輕吹打細胞,完全脫落后吸出,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻.
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,將細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中.
PS：若客戶收到2ml小管細胞,收到細胞后,用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內,嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,加入5ml左右完全培養(yǎng)基混勻,放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細胞密度：若密度未超過80%,換液繼續(xù)培養(yǎng),視情況傳代或者凍存.若密度超過80%,可直接進行傳代（方法同上）.
Bend.3小鼠腦微血管內皮細胞培養(yǎng)說明書
3）細胞凍存：
1 細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞一次；2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心5min；
3 用適量的凍存液重懸細胞,并放置于凍存管中；
4 先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,然后將其移入-80℃.
四 售后服務告知書
1）細胞出現(xiàn)問題,可重發(fā)的情況有哪些？判定標準是什么？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題,細胞丟失 瓶身破損 培養(yǎng)液嚴重漏液等,重發(fā)；
2. 細胞污染問題,請在收到產品48小時內,給我們提出真實的實驗結果,核實后重發(fā)；
3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后,干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后,絕大多數(shù)細胞未存活,（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片）,重發(fā)；
4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,出現(xiàn)污染,重發(fā)；
5. 細胞活性問題,請在收到產品7天內給我們提出真實的實驗結果,用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,核實后予重發(fā)；
6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照,3天未告知的,視為產品合格.4-7天內出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的,并跟技術人員溝通的,由技術人員判定為我方責任的,重發(fā).技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā).
二）細胞出現(xiàn)問題,不予以重發(fā)的情況有哪些？
1. 客戶造成細胞污染,不重發(fā)；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；
3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；
4. 細胞狀態(tài)不好,未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的,不重發(fā)；
5. 細胞培養(yǎng)時經其它處理的,不重發(fā)；
6. 細胞收到2天內,未告知,不重發(fā)；
7. 視具體情況而定.
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