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布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量熒光探針PCR試劑盒

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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:布魯氏菌檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)

英文名稱:Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】   50T/

【預(yù)期用途】

布魯氏菌。Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的畜源性人畜共患傳染病,在牛、羊、豬中常發(fā)生,患病家畜是人類布魯氏菌病的主要傳染源。近年來(lái)全國(guó)各地布魯氏菌病疫情有上升的趨勢(shì),給畜牧業(yè)發(fā)展及人類身體健康帶來(lái)極大的危害和威脅,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,主要用于布魯氏菌的定性篩查檢測(cè)。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)布魯氏菌基因設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針,在待檢樣本中含有布魯氏菌DNA的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號(hào)

組成

50T/

1

 布魯氏菌 PCR反應(yīng)液

875 μL×1

2

布魯氏菌 混合酶液

125 μL×1

3

布魯氏菌 陰性對(duì)照

 40 μL×1

4

布魯氏菌 陽(yáng)性對(duì)照

 40 μL×1

5

說(shuō)明書

1

注:陰性對(duì)照為不含布魯氏菌的其它菌的混合物,陽(yáng)性對(duì)照為滅活的布魯氏菌。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 如使用原始標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本(病人腦脊液、靜脈血、關(guān)節(jié)液;病畜靜脈血,乳汁;菌落,菌苔等)應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本。

2. 如需在增菌后進(jìn)行PCR檢測(cè),則應(yīng)使用選擇性增菌液對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行增菌。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè),可置于28℃冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20-80

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表()

PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液(Taq+UNG酶)

 2.5 μL

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書操.

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCRPCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集布魯氏菌熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

50℃2分鐘(min

1

預(yù)變性

95℃3分鐘(min

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃5秒(s

5

55℃40秒(s

PCR擴(kuò)增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct≤35。

2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出布魯氏菌

陽(yáng)性(+)

標(biāo)本中檢測(cè)出布魯氏菌

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102CFU,產(chǎn)品CV≤5%

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。

3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染,必須將混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號(hào)試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。


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