產(chǎn)品及特點(diǎn) | 大腸埃希氏菌,俗稱大腸桿菌(Escherichia coli),屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。 | ||||
大腸桿菌 O157:H7 是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia | |||||
coli, EHEC)的最常見類型,O 表示抗原類型, H7 表示血清型。其感染劑量極低, | |||||
人體只要攝入 10 個細(xì)菌就可以致病,目前還沒有特效疫苗,因此大量開展預(yù)防 | |||||
檢測工作具有重要的意義。目前對 O157 的檢測主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學(xué) | |||||
和分子水平的 PCR 檢測。本試劑盒就是利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)開發(fā)的大 | |||||
腸桿菌 O157:H7 檢測試劑盒,它通過熒光染料實時顯示樣品模板 DNA 的量, | |||||
并通過坐標(biāo)曲線表示出來,結(jié)果直觀準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn): | |||||
1.即開即用,用戶只需要提供樣品模板,操作簡單,定量準(zhǔn)確快速。 | |||||
2.熒光定量 PCR 檢測,反應(yīng)特異性強(qiáng)。 | |||||
3.本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。 | |||||
規(guī)格及成分 |
| 成分 | 編號 | 50 次塑料袋包裝 |
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2×qPCR Mix | 90408 | 1.0 mL | |||
O157:H7 專一性引物對 | yw13851386 | 200 μL | |||
O157:H7 陽性對照, XXX 10E9 拷貝/μL |
yw13871388 |
100 μL | |||
超純水 | 100935 | 1 mL | |||
使用手冊 | 1 份 | ||||
運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限一年。 | ||||
自備試劑 | 樣品等 | ||||
使用方法 | 一、樣品 DNA 的制備 | ||||
用自選方法提取細(xì)菌樣品 DNA。注意:DNA 純化方法是決定檢測靈敏度的 | |||||
關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA,后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢 | |||||
測靈敏度。 | |||||
二、制備 O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(以 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo) | |||||
準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣 | |||||
品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品 | |||||
不提供活體病毒做陽性對照,只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DNA 片段 | |||||
作為陽性對照。 | |||||
1.標(biāo)記 6 個離心管,分別為 6,5,4,3,2 和 1 號。 | |||||
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水(最好用帶芯槍頭,下同)。 |
| 3.先將本試劑盒提供的陽性對照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到 | ||||
10E7 拷貝/μL(注:請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 | |||||
拷貝/μL,建議每次稀釋 10 倍,梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL)。 | |||||
4.在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 O157:H7 陽性對照(上步稀釋所 | |||||
得),充分震蕩 1 分鐘,得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。 | |||||
5.換槍頭,從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 10E5 | |||||
拷貝/μL 的陽性對照。 | |||||
6.換槍頭,從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中,重復(fù)上面的操作直到得到 6 | |||||
個稀釋度的陽性對照。 | |||||
7.NC 管中不加任何陽性對照。 | |||||
8.從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進(jìn)行定量 PCR(見下步),每個 | |||||
樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值, | |||||
并以之為縱軸,以濃度的對數(shù)值為橫軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 | |||||
三、PCR 檢測(20 μL 體系) | |||||
1.在 PCR 管中加入下列成分(待測樣品需要做三次重復(fù),下表只列出一次): | |||||
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光 PCR | |||||
儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 | |||||
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX。 | |||||
2.建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化) | |||||
| 過程 | 溫度 | 時間 |
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預(yù)變性 | 95℃ | 10 min |
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| PCR 反應(yīng) (40 個循環(huán)) | 94℃ | 15 s |
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60℃ | 30 s | ||||
3.數(shù)據(jù)采集 | |||||
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 | |||||
DNA 時,最大吸收光譜在 471 nm,結(jié)合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm, | |||||
最大發(fā)射光譜在 530 nm。 | |||||
四、數(shù)據(jù)處理 | |||||
以 O157:H7 陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 | |||||
線。再以待測樣品濃度的 log 為橫軸,以 Ct 值為縱軸,通過待測樣品的 Ct 值 | |||||
計算出樣品 DNA 的濃度。 | |||||
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | 鸚鵡熱衣原體熒光定量 PCR 檢測試劑盒(CAT#:11-3780) |