口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測試劑盒(雙色實(shí)時(shí)熒光 PCR 法)說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測試劑盒(雙色實(shí)時(shí)熒光 PCR 法)
英文名稱:Foot and Mouth Disease Virus、Seneca virus A Detection Kit (Dual ChanelReal-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測,可用于臨床口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒基因組模板的情況下,PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量 PCR 儀對PCR 過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | SVA/FMDV RT-PCR 反應(yīng)液 | 437.5 μL×1 管 | 875 μL×1 管 |
2 | SVA/FMDV 混合酶 | 62.5 μL×1 管 | 125 μL×1 管 |
3 | SVA/FMDV 陽性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
4 | SVA/FMDV 陰性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
5 | 說明書 | 1 份 | 1 份 |
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注:陰性對照為豬基因組 DNA,陽性對照為失去活性的口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒cDNA。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad 系列、Agilent Stratagene MX 系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。
【樣本要求】
1. 血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
2. 肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3 克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min離心 10 分鐘取上清待檢。
3. 應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4. 標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于 2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1) 從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
(2) 核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | RT-PCR 反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶 | 2.5 μL |
(3) 在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR 反應(yīng)管。
2. 樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用 QIAGEN、Roche 公司 RNA 提取試劑盒提取 RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3. 加樣
在上述制備好的 PCR 反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本 RNA 各 5 μl、終體積 25 μl/管,蓋好 PCR 反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR 儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加 5 μL 試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為 25 μl/管,蓋好 PCR 反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到 PCR 儀器上。
4. PCR(PCR 擴(kuò)增區(qū))
(1) 取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的 PCR 反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2) 按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | ROX 通道采集口蹄疫病毒熒光信號 FAM 通道采集塞內(nèi)卡病毒熒光信號 |
PCR 反應(yīng)條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃:10 分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3 分鐘(min) | 1 | |
PCR 擴(kuò)增 | 95℃:5 秒(s) |
40 | |
55℃:40 秒(s) (此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號) |
注:ABI 系列熒光 PCR 儀在設(shè)置時(shí)不選 ROX 校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇 None。
【參考值(參考范圍)】
1. 試劑盒有效性判定:
(1) 陽性對照:有典型 S 型擴(kuò)增曲線或 Ct 值≤35。
(2) 陰性對照:Ct 值>38 或無 Ct 值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2. 標(biāo)本結(jié)果判定:
(1) 陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值≤35 或有明顯指數(shù)增長期。
(2) 可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值在 35~38 范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在35~ 38 范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3) 陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 | |
ROX | FAM | |
+ | + | 標(biāo)本中檢出口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒 RNA |
+ | - | 標(biāo)本中檢出口蹄疫病毒 RNA,未檢出塞內(nèi)卡病毒 RNA |
- | + | 標(biāo)本中檢出塞內(nèi)卡病毒 RNA,未檢出口蹄疫病毒 RNA |
- | - | 標(biāo)本中未檢出口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒 RNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成 RNA 降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為 103 Copies/mL,產(chǎn)品 CV 值≤3%。
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室,應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理;
2. 為避免 RNA 降解,樣本處理過程應(yīng)在 0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理;
3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染;檢測結(jié)束后,應(yīng)立即對工作臺(tái)清潔;
4. 吸取反應(yīng)液時(shí),應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡;上 PCR 儀前,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確;
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心;
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放;
7. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸 PCR 反應(yīng)管,并應(yīng)避免在 PCR 反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記;
8. 檢測過程中使用過的吸頭,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的 PCR 反應(yīng)管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄;工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒;
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號試劑不能混用;并在有效期內(nèi)使用。