GreenNuc™活細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(GreenNuc™ Caspase-3 Assay Kit for Live Cells)是一種使用新型的具有細(xì)胞膜通透性的Caspase-3/7綠色熒光底物來(lái)檢測(cè)活細(xì)胞中Caspase-3/7活性的試劑盒，可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞的凋亡情況。

Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3也稱CPP32、Yama或apopain，有時(shí)被寫作Caspase 3或caspase 3，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。Caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究最多的一個(gè)caspase。Caspase-3可以剪切procaspase-3、6、7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly (ADP-ribose) polymerase)、ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、gelsolin和fodrin等。這些由Caspase-3介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。另外，Caspase-3在細(xì)胞核凋亡過(guò)程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。同時(shí)Caspase-3對(duì)細(xì)胞起泡(cell blebbing)也起到關(guān)鍵作用。
本試劑盒的檢測(cè)原理參見(jiàn)圖1。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate為耦合DNA綠色熒光染料的多肽DEVD，該底物中的DEVD是caspase 3/7的識(shí)別序列，并帶有大量負(fù)電荷。這些負(fù)電荷和DNA帶有的負(fù)電荷相互排斥，使底物中的DNA綠色熒光染料不能結(jié)合DNA，也就不能被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。當(dāng)最初沒(méi)有熒光的底物穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在凋亡細(xì)胞中被Caspase-3/7識(shí)別并剪切，從而釋放出活化的DNA綠色熒光染料分子。當(dāng)這種DNA綠色熒光染料遷移進(jìn)入細(xì)胞核，并和DNA結(jié)合后，就可以被激發(fā)而產(chǎn)生明亮的綠色熒光。

圖1. GreenNuc™活細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理圖。

檢測(cè)試劑直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，孵育15-30分鐘后即可直接用于熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。本試劑盒同時(shí)提供了Caspase-3/7的可逆抑制劑Ac-DEVD-CHO，以方便確認(rèn)本試劑盒的檢測(cè)效果。HeLa細(xì)胞用本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效果參見(jiàn)圖2。

圖2. HeLa細(xì)胞用GreenNuc™活細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效果圖。未誘導(dǎo)凋亡組觀察不到綠色熒光(最左側(cè)一列)；用10μM Camptothecin(喜樹(shù)堿)孵育過(guò)夜誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并加入5μM GreenNuc™ Caspase-3 Substrate孵育30分鐘，可以觀察到凋亡細(xì)胞細(xì)胞核處的綠色熒光(中間一列)；而在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)加入20μM Caspase-3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO同時(shí)孵育，凋亡陽(yáng)性的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量被顯著抑制，說(shuō)明Caspase-3/7被抑制后，底物不能被剪切，沒(méi)有活化的DNA綠色熒光染料進(jìn)入細(xì)胞核并染色基因組DNA (最右側(cè)一列)。

本試劑盒檢測(cè)可以實(shí)時(shí)檢測(cè)凋亡情況。傳統(tǒng)的Caspase活性檢測(cè)試劑盒，通常需要裂解細(xì)胞或組織樣品后進(jìn)行顯色或熒光檢測(cè)，而不能用于活細(xì)胞的Caspase活性檢測(cè)。通過(guò)Western檢測(cè)Caspase本身的剪切激活，也只能檢測(cè)樣品中的Caspase的平均酶活性。基于熒光標(biāo)記的Caspase抑制劑的檢測(cè)技術(shù)(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以進(jìn)入活細(xì)胞檢測(cè)Caspase活性，但其熒光探針本身就是不可逆的Caspase抑制劑，所以無(wú)法在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)檢測(cè)Caspase的活力。本試劑盒中的底物不會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡過(guò)程，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡的進(jìn)度。
本試劑盒是雙功能的：既可以檢測(cè)Caspase-3/7的活性，又可以顯示細(xì)胞核在凋亡過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。在眾多凋亡的細(xì)胞內(nèi)，不同細(xì)胞可能處在不同時(shí)期并經(jīng)歷著凋亡過(guò)程中的不同事件，因而研究中很重要的一點(diǎn)就是能實(shí)時(shí)獨(dú)立地跟蹤這些事件，從而更好地了解事件之間的相互關(guān)系。本試劑盒可以和其它一些熒光探針(如線粒體探針、其它凋亡探針)配合，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀來(lái)研究這些不同事件的時(shí)間、空間關(guān)系。
本試劑盒后續(xù)兼容性強(qiáng)：使用本試劑盒檢測(cè)后，后續(xù)可以繼續(xù)使用多聚甲醛固定，并進(jìn)行后續(xù)的各種免疫染色，包括免疫熒光、免疫組化等。
本試劑盒小包裝C1168S如果用于96孔板或流式細(xì)胞儀可以進(jìn)行20-40次檢測(cè)，96孔板每孔檢測(cè)體系的體積為100μl時(shí)可以檢測(cè)40次，檢測(cè)體系體積為200μl時(shí)僅可以檢測(cè)20次；C1168M可檢測(cè)樣品的數(shù)量為小包裝C1168S的5倍。實(shí)際檢測(cè)次數(shù)會(huì)因?yàn)闄z測(cè)體系和使用的底物濃度而有所不同。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。GreenNuc™ Caspase-3 Substrate須-20℃避光保存。
注意事項(xiàng)：
本試劑盒染色兼容多聚甲醛或甲醛固定，但與甲醇固定不兼容。建議用4%多聚甲醛固定10-15分鐘，固定后的細(xì)胞可以用免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或含有0.1% Triton X-100的適當(dāng)溶液進(jìn)行通透處理后進(jìn)行后續(xù)染色。固定或通透等處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)本試劑盒染色的亮度會(huì)有一定的影響。
熒光染料有一定的淬滅性，請(qǐng)注意避免長(zhǎng)時(shí)間在熒光顯微鏡下觀察。
本試劑盒組分須盡量避免反復(fù)凍融。如果多次使用，請(qǐng)注意適當(dāng)分裝。
Ac-DEVD-CHO在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
有文獻(xiàn)報(bào)道少數(shù)類型的細(xì)胞凋亡檢測(cè)不到Caspase-3/7的激活。
本試劑盒染色后，推薦使Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100X) (C1027/C1028/C1029)復(fù)染，復(fù)染后可見(jiàn)所有細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。