可用于防止PCR產(chǎn)物交叉污染;單核苷酸多態(tài)性檢測;位點特異性突變;蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究;SNP基因分型;PCR產(chǎn)物克。恢苽浜袉捂溚怀瞿┒说腜CR產(chǎn)物或cDNA等。
Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod),也稱Heat-labile Cod UDG,即熱敏型鱈魚UDG,是來源于大西洋鱈魚(Gadus morhua cod),可催化含尿嘧啶的DNA鏈中的尿嘧啶(dU)堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵發(fā)生水解,從而釋放游離尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的單鏈或雙鏈DNA,但不能水解RNA或含有dU的長度不超過6個堿基DNA寡聚體。
UDG主要應用于消除PCR擴增過程中帶來的產(chǎn)物污染問題。其防止污染的原理為:在PCR反應中加入適量的dUTP,以dUTP替代dTTP摻入DNA中,形成含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物;后續(xù)進行PCR反應時,使用UDG酶選擇性切割可能被污染而帶入的之前PCR擴增產(chǎn)生的含有dU的單鏈或雙鏈DNA,從而避免之前的PCR擴增產(chǎn)物可能的污染對于本次PCR擴增帶來的負面影響。
本產(chǎn)品為熱敏型,在50℃孵育10分鐘可以迅速不可逆滅活。在PCR或RT-PCR反應前,PCR或RT-PCR體系中加入Heat-labile Cod UDG室溫處理5min,即可充分消除可能的之前的含有dUTP的PCR擴增產(chǎn)物的污染。本產(chǎn)品不僅適用于PCR,也適用于qPCR、RT-PCR和qRT-PCR等體系。
活性定義:One unit is the amount of enzyme required to liberate 1 nmol uracil from dU-containing DNA in one hour at 37℃.
Heat-labile Cod UDG酶活性鑒定結(jié)果可參考圖1。
圖1.Heat-labile Cod UDG催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物效果圖。使用本產(chǎn)品或國外N公司的酶,在20µl體系,分別以5µl含dU堿基的PCR擴增1500bp PCR產(chǎn)物為底物和不同量的(0U, 0.01U, 0.02U, 0.04U, 0.2U) Heat-labile Cod UDG,在1X Heat-labile Cod UDG Buffer,37℃孵育1h,然后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖所示,本產(chǎn)品與N公司相比,具有相當?shù)拿富睢, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
Heat-labile Cod UDG 經(jīng)滅活處理后酶活鑒定結(jié)果可參考圖 2。
圖2.Heat-labile Cod UDG以及生產(chǎn)的E. coli UDG (D7360)經(jīng)50℃10min處理后,催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物效果圖。將不同量的E. coli UDG (0U, 0.005U, 0.01U, 0.025U)和以及N公司不同量的Heat-labile Cod UDG (0U, 0.02U, 0.04U, 0.2U)經(jīng)50℃ 10min處理之后,在20µl體系,分別以5µl含dU堿基的PCR擴增1500bp PCR產(chǎn)物為底物,在1X Heat-labile Cod UDG Buffer,37℃孵育1h,然后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖所示,E. coli UDG50℃處理10min之后酶活僅輕微下降,而Heat-labile Cod UDG均完全滅活。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
來源:大腸桿菌重組、表達和純化而獲得。
純度:不含UDG酶活力之外的內(nèi)切或外切脫氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。
用途:去除含尿嘧啶的單鏈或雙鏈DNA;去除含dU的PCR產(chǎn)物氣溶膠污染;DNA修復與突變檢測;提高PCR產(chǎn)物的克隆效率;提高點誘變的效率;研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用。用于PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、one-step RT-PCR體系。
酶儲存溶液:50mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100, 50% (v/v) glycerol。
10X Heat-labile Cod UDG Buffer:700mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1mg/ml BSA, pH 8.0 at 25℃。
失活或抑制:50℃加熱10min可以使Heat-labile Cod UDG完全失活。
包裝清單:
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D7364S-1 | Heat-labile Cod UDG (1U/μl) | 200µl |
D7364S-2 | 10X Heat-labile Cod UDG Buffer | 2ml |
— | 說明書 | 1份 |
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D7364M-1 | Heat-labile Cod UDG (1U/μl) | 1ml |
D7364M-2 | 10X Heat-labile Cod UDG Buffer | 5ml |
— | 說明書 | 1份 |
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D7364L-1 | Heat-labile Cod UDG (1U/μl) | 5ml |
D7364L-2 | 10X Heat-labile Cod UDG Buffer | 10ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,至少一年有效。
注意事項:
Heat-labile Cod UDG酶在大多數(shù)PCR反應緩沖液中均具有活性,但對于自行使用的PCR或RT-PCR體系,首次使用時建議先測試一下是否和所使用的體系兼容。通常取含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物,參考圖1加入適量UDG,觀察能否有效降解含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物。
dNTP/dUTP推薦選購D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。
Heat-labile Cod UDG長期儲存請置于-80℃保存,常規(guī)使用請于-20℃保存。-80℃保存會結(jié)凍,盡量避免反復凍融。
如果需要將Heat-labile Cod UDG酶應用于One-Step RT-PCR或者One-Step qRT-PCR體系,需要選擇耐熱反轉(zhuǎn)錄酶,并需要將逆轉(zhuǎn)錄溫度設置為50℃-55℃。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.按照常規(guī)反應體系設置PCR或RT-PCR反應體系,同時加入Heat-labile Cod UDG至最終濃度為0.01U/μl,混勻。通常僅加入PCR或RT-PCR的buffer即可,無需加入UDG的buffer。
2.25℃孵育5min (去除可能的含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物的污染),隨后進入PCR或RT-PCR程序。