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pAdEasy-1/BJ5183 甘油菌(腺病毒重組配套菌)

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 pShuttle-CMV-C-DsRed (腺病毒質(zhì)粒, 紅色熒光)是自行研發(fā)的用于構(gòu)建表達(dá)C端DsRed(紅色熒光蛋白)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質(zhì)粒。本穿梭質(zhì)粒構(gòu)建后,需要和預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)以及重組腺病毒包裝細(xì)胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle-CMV-C-DsRed質(zhì)粒可以用于在包裝成腺病毒后表達(dá)C端含DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein,香菇珊瑚紅色熒光蛋白)標(biāo)簽的融合蛋白。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子,可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。在多克隆位點(diǎn)的后面有一個(gè)DsRed的完整編碼序列,因此在多克隆位點(diǎn)根據(jù)閱讀框插入目的基因就可以表達(dá)C端含有DsRed標(biāo)簽的融合蛋白。利用DsRed的熒光特性可以比較容易地觀察融合蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位,也可以利用DsRed抗體來檢測(cè)或免疫沉淀融合蛋白。DsRed與GFP沒有序列同源性,不能使用GFP抗體檢測(cè)DsRed。

本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。

重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細(xì)胞范圍廣、感染不依賴細(xì)胞分裂、高滴度及目的基因表達(dá)水平高等特性。最常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒,刪除了在病毒裝配過程中起關(guān)鍵作用的E1基因和非必須的能表達(dá)逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復(fù)制,同時(shí)給外源基因的插入提供了空間,最長(zhǎng)可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細(xì)胞作為包裝細(xì)胞就可以完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle系列的穿梭質(zhì)粒攜帶外源目的基因,經(jīng)過Pme I線性化,隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(D8106)共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中,或者轉(zhuǎn)化到已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)化了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重組。BJ5183菌株表達(dá)recET基因,具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性,使帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過末端反向重復(fù)序列同源重組,實(shí)現(xiàn)外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。

目的基因引入時(shí)不能含有Pme I及Pac I這兩個(gè)酶切位點(diǎn),如果含有該兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因,需要對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變方可進(jìn)行基因操作。

pShuttle-CMV-C-DsRed主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
left inverted terminal repeat 1–103
encapsidation signal (ES) 183–331
CMV promoter 341–933
multiple cloning site 940–988
DsRed 993-1670
SV40 polyA 1690–1901
Ad5 right arm homology 1906–4160
Ad5 left arm homology 4208–5091
right inverted terminal repeat 4192–5194
pBR322 origin 5402–6069
kanamycin resistance ORF 6878–7669

pShuttle-CMV-C-DsRed 質(zhì)粒(8155bp)的圖譜如下:

pShuttle-CMV-C-DsRed質(zhì)粒的詳細(xì)圖譜見說明書:https://www.beyotime.com/Manual/D8115 pShuttle-CMV-C-DsRed.pdf。

pShuttle-CMV-C-DsRed 中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-DsRed)包括:

Acc65I Afl II Age I Asc I Asp718
Blp I BsiC I BsiW I BstB I Bsu36 I
Cla I Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Kpn I Nru I Pml I Pvu I Sfi I

pShuttle-CMV-C-DsRed 中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-DsRed once)包括:

SnaB I TAC|GTA 679 Sca I AGT|ACT 1683
Nhe I G`CTAG,C 940 Hpa I GTT|AAC 1800
Not I GC`GGCC,GC 945 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 3017
BamH I G`GATC,C 952 Bst1107 I GTA|TAC 4173
Hind III A`AGCT,T 958 Xca I GTA|TAC 4173
EcoR V GAT|ATC 966 Pme I CTTT|AAAC 4194
Sal I G`TCGA,C 970 EcoR I G`AATT,C 4199
Mlu I A`CGCG,T 976 Avr II C`CTAG,G 4741
PaeR7 I C`TCGA,G 988 BspH I T`CATG,A 6137
Xho I C`TCGA,G 988 Psp1406 I AA`CG,TT 6536
Stu I AGG|CCT 1204 Rsr II CG`GWC,CG 7542
Xba I T`CTAG,A 1672 Xmn I GAANN |NNTTC 8143
Spe I A`CTAG,T 1678      

pShuttle-CMV-C-DsRed 質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1692-1714): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-C-DsRed的全序列信息:pShuttle-CMV-C-DsRed2.txt

 
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