谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)(Glutathione Reductase Assay Kit with DTNB)是一種簡單易行的通過比色法來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性的試劑盒。谷胱甘肽還原酶在許多組織中都有分布,可以維持細(xì)胞內(nèi)充足的還原型谷胱甘肽(GSH)水平。GSH可以清除自由基和一些有機(jī)過氧化物,或作為谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase)的底物來清除一些過氧化物。
谷胱甘肽還原酶可以還原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成還原型谷胱甘肽(GSH),而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG,并可以通過測定A412來檢測TNB的生成量。適當(dāng)設(shè)置應(yīng)體系,前后兩個(gè)反應(yīng)合并起來后,GSSG/GSH過量而GR相對不足時(shí),該反應(yīng)體系中谷胱甘肽還原酶就成為整個(gè)反應(yīng)體系的限速因素,此時(shí)黃色的TNB生成量和谷胱甘肽還原酶的活性呈線性正相關(guān)。從而通過測定A412就可以計(jì)算出谷胱甘肽還原酶的活性水平。本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下:
兩個(gè)反應(yīng)相合并:
本試劑盒檢測肝臟樣品的檢測效果如圖1所示。圖中可見,對于肝臟樣品可以檢測到比較強(qiáng)的谷胱甘肽還原酶的活性并且有很好的劑量效應(yīng)。
圖1. 谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)用于肝臟裂解樣品的實(shí)測效果圖。包裝清單:
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
S0055-1 | 谷胱甘肽還原酶檢測緩沖液 | 50ml |
S0055-2 | 樣品稀釋液 | 50ml |
S0055-3 | NADPH | 5mg |
S0055-4 | 氧化型谷胱甘肽(GSSG) | 14.2mg |
S0055-5 | DTNB | 4.5mg |
S0055-6 | DMSO | 1.5ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,一年有效。NADPH溶解后宜分裝并-70℃保存,4℃可以保存一天,-20℃保存一周后NADPH會降解10%以上。GSSG和DTNB在配制成溶液后,適當(dāng)分裝后-20℃保存。
注意事項(xiàng):
本試劑盒檢測時(shí)涉及氧化還原反應(yīng),因此所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定。如果在樣品中的還原劑無法避免,例如DTT、巰基乙醇等,則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。另外,硫酸鈉、硫酸銨和鐵氰化物都會干擾本試劑盒的測定。請盡量避免。
樣品可以立即測定,也可以-70℃凍存待以后測定。
一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)的溫度為25℃,否則會引起較多誤差。
NADPH不太穩(wěn)定,要嚴(yán)格按照后續(xù)說明操作,謹(jǐn)防失活。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.樣品的準(zhǔn)備:
a.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。對于貼壁細(xì)胞,由于后續(xù)用于酶活性的測定,應(yīng)避免使用胰酶消化細(xì)胞,可以用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。對于懸浮細(xì)胞,可以離心收集細(xì)胞,并用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。后續(xù)可以用Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)參考相應(yīng)的說明裂解細(xì)胞樣品。按照每100萬細(xì)胞直接加入100-200微升裂解液的比例進(jìn)行裂解。對于貼壁細(xì)胞,可以使用細(xì)胞鏟或細(xì)胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)輔助收集細(xì)胞樣品。如果出現(xiàn)裂解效果不佳的情況,可以把處在裂解液中的細(xì)胞樣品用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。隨后4℃,12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
b.組織樣品的準(zhǔn)備。動物用含有0.16mg/ml heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照約每20mg組織加入200微升Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液的比例,用TissueMaster™手持式組織研磨儀(E6600)或玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃,12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
c.紅細(xì)胞裂解液的準(zhǔn)備。用抗凝管收集血液,顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500×g離心5分鐘。棄上清,用冰冷的約紅細(xì)胞沉淀10倍體積的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液重懸沉淀,再同前離心,棄上清。加入約紅細(xì)胞沉淀4倍體積的冰冷的Milli-Q級純水裂解紅細(xì)胞。12,000×g離心5分鐘,取上清。
d.上述各種樣品可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通常可以先取含1-100微克蛋白的樣品用于谷胱甘肽還原酶的檢測。注:對于GR活力較高的組織樣品,含1-10微克蛋白的樣品可能就能滿足檢測需求,而對于GR活力較低的樣品,可能需要10-100微克的蛋白量。如果發(fā)現(xiàn)樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過高,可以用谷胱甘肽還原酶檢測緩沖液進(jìn)行稀釋。如果樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過低,則需適當(dāng)加大蛋白用量。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)日測定,可以在冰浴或4℃臨時(shí)保存;如果不能當(dāng)日檢測,可以-70℃凍存。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作:
a.配制6mM NADPH溶液的配制。在本試劑盒提供的5mg NADPH中加入1ml Milli-Q級純水或重蒸水,溶解并混勻,即為6mM NADPH溶液。除立即待用部分外,其余的NADPH溶液需適當(dāng)分裝后盡快-70℃保存。
b.GSSG溶液的配制。在本試劑盒提供的14.2mg GSSG中加入10ml Milli-Q級純水,溶解并混勻。除立即待用部分外,其余的GSSG溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.DTNB溶液的配制。在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO,溶解并混勻。除立即待用部分外,其余的DTNB溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
d.所有試劑在使用前均須在水浴中或PCR儀等設(shè)備上溫育到25℃。
3.樣品測定:
a.參考下表(表1),使用96孔板,依次加入各溶液,混勻。
空白對照 (blank) | 樣品(sample) | |
GSSG溶液 | 100μl | 100μl |
谷胱甘肽還原酶檢測緩沖液 | 90μl | 70-90μl |
樣品 | 0μl | 0-20μl |
NADPH溶液(6mM) | 10μl | 10μl |
總體積 | 200μl | 200μl |
b.加入6.6微升DTNB溶液,混勻。
c.立即使用適當(dāng)?shù)拿笜?biāo)儀或微量紫外分光光度計(jì)測定A412,此時(shí)記錄為0分鐘讀值,即A412 (Time 0)。如果儀器可以設(shè)置溫度,把溫度設(shè)置在25℃,否則可以通過空調(diào)調(diào)節(jié)室溫到25℃,待預(yù)計(jì)儀器也達(dá)到25℃后再開始測定A412。
d.每隔2分鐘記錄A412值,即A412 (Time n),至少連續(xù)記錄10分鐘,獲得5個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù);蛘呷绻麅x器具備相應(yīng)功能,可以讓儀器連續(xù)測定10分鐘或自動每隔2分鐘測定一次A412。如果樣品的吸光度比較低,可以延長孵育時(shí)間,樣品的吸光度在一定范圍內(nèi)會隨時(shí)間的延長接近于線性增加的,此時(shí)可以考慮每10分鐘測定一次吸光度。
4.樣品中谷胱甘肽還原酶酶活力的計(jì)算:
a.谷胱甘肽還原酶酶活力單位的定義:1個(gè)酶活力單位(1 unit)在25℃,pH7.5的條件下,在1分鐘內(nèi)可以還原化1微摩爾GSSG。1 U=1000 mU。
b.計(jì)算時(shí)每個(gè)樣品的A412/min都需要扣除相應(yīng)的樣品本底對照測定出來的A412/min。測定出來的ΔA412/min最好能控制在0.005-0.1范圍內(nèi)。如測定出來的ΔA412/min數(shù)值過大,則可以把樣品適當(dāng)稀釋或者減小樣品的用量,如ΔA412/min數(shù)值過小,處理樣品時(shí)需設(shè)法盡量濃縮樣品、并適當(dāng)加大樣品的用量。肝臟裂解樣品的實(shí)測效果參考圖1。
注:ΔA412 (blank)=A412 (blank, Time n)-A412 (blank, Time 0);
ΔA412 (sample)=A412 (sample, Time n)-A412 (sample, Time 0);
ΔA412=ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank);
ΔA412/min=ΔA412/n
c.對于谷胱甘肽還原酶:1mU/ml=1nmol TNB/min/ml=(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))
即相當(dāng)于:[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (ΔA412/min)/(εμM×L(cm))=[(ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank))/min]/ (εμM×L(cm))
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]=[檢測體系中消耗谷胱甘肽還原酶活力]×[稀釋倍數(shù)]/[樣品中的蛋白濃度] = [(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/Vsample(ml))]/[樣品中的蛋白濃度]
注:[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為mU/ml,[樣品中的蛋白濃度]的單位為mg/ml,所以最終[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為:U/mg蛋白或mU/mg蛋白;
εμM為摩爾消光系數(shù):TNB在A412的摩爾消光系數(shù)為0.01415μM-1cm-1;
L(cm)為測吸光度時(shí)的路徑長度:200μl樣品在一般的96孔中的高度約為0.552cm,如果使用不同的反應(yīng)孔,請注意修改為溶液在該孔中的高度;
dil為樣品的稀釋倍數(shù);
V(ml)為反應(yīng)體系,本反應(yīng)體系為0.2ml;
Vsample(ml)為反應(yīng)體系中樣品的體積,以毫升表示。
d.計(jì)算示例:樣品的蛋白濃度經(jīng)測定為5mg/ml,用樣品稀釋液稀釋10倍后,取10微升稀釋后的樣品參考表1進(jìn)行測定。如果ΔA412/min(sample)=0.048,ΔA412/min(blank)=0.006,那么:
[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (0.048-0.006)/(0.01415×0.552) =5.38mU/ml
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]= 5.38mU/ml×10×0.2/0.01/(5mg/ml)= 0.2152U/mg(蛋白)