Annexin V-mCherry/SYTOX Green細胞凋亡檢測試劑盒(Cell Apoptosis Detection Kit with Annexin V-mCherry and SYTOX Green)是一種用細胞凋亡熒光探針Annexin V-mCherry聯(lián)合死細胞綠色熒光探針SYTOX Green來檢測細胞凋亡及壞死的一種試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。
本試劑盒檢測的是Annexin V-mCherry紅色熒光和SYTOX Green的綠色熒光，Annexin V-mCherry熒光蛋白的最大激發(fā)光波長為587nm，最大發(fā)射光波長為610nm；SYTOX Green插入DNA后最大激發(fā)光波長為504nm，最大發(fā)射光波長為523nm。Annexin V-mCherry和SYTOX Green的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。
圖1. Annexin V-mCherry和SYTOX Green的激發(fā)和發(fā)射光光譜。
細胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當(dāng)細胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調(diào)控的自殺保護措施，去除體內(nèi)非必需細胞或即將發(fā)生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
細胞凋亡通過特征性的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化而區(qū)別于壞死(Necrosis)，包括細胞皺縮、細胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)位于細胞膜的近細胞質(zhì)面。而在凋亡細胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細胞表面即細胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細胞外部。在白細胞的凋亡過程中，白細胞表面的PS標(biāo)記可以被巨噬細胞識別，從而最終被巨噬細胞吞噬。人血管抗凝血劑Annexin V是一種35-36kDa Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高親和力。用紅色熒光蛋白的mCherry標(biāo)記的Annexin V (Annexin V-mCherry)染色細胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等熒光檢測設(shè)備非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。需要指出的是對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性被破壞，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的PS也會被Annexin V-mCherry染色。
Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細胞膜內(nèi)側(cè)，即與細胞漿相鄰的一側(cè)。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
SYTOX Green是一種非細胞膜滲透性的花菁熒光染料，不能穿過具有生物活性的細胞質(zhì)膜，只能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋形成SYTOX Green-DNA復(fù)合物，熒光強度增加500倍以上，從而產(chǎn)生明亮的綠色熒光，因此SYTOX Green僅能對死細胞染色，從而被用來區(qū)分正常細胞與壞死細胞。
Annexin V-mCherry相比藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡稱PE)標(biāo)記的Annexin V，激發(fā)光譜更窄，不會像PE那樣在495nm左右產(chǎn)生紅色熒光，非常適合與其它綠色熒光一同檢測，在進行流式檢測時幾乎不需要進行任何補償。
本產(chǎn)品使用便捷，結(jié)果清晰。正常細胞不會被Annexin V-mCherry和SYTOX Green所染色，凋亡細胞和壞死細胞都會被Annexin V-mCherry所染色，壞死細胞的細胞核被SYTOX Green染成明亮的綠色熒光。有報道稱，凋亡中晚期細胞的細胞核被SYTOX Green染成較弱的綠色熒光。使用本試劑盒檢測細胞凋亡和細胞壞死的效果參考圖2。
圖2. Annexin V-mCherry/SYTOX Green細胞凋亡檢測試劑盒檢測BGC-823 (人胃癌細胞)細胞凋亡和壞死的效果。正常狀態(tài)的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細胞不會被Annexin V-mCherry和SYTOX Green所染色(圖B-D)。Camptothecin誘導(dǎo)16小時后的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖E；凋亡和壞死細胞的細胞膜呈紅色熒光(圖G-H)；凋亡細胞的細胞核成較弱的綠色熒光，壞死細胞的細胞核呈明亮的綠色熒光(圖F)。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。
一個小包裝的本試劑盒C1070S共可以檢測20個樣品，中包裝的試劑盒C1070M可以檢測50個樣品。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1070S-1 | Annexin V-mCherry | 100μl |
| C1070S-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 12ml |
| C1070S-3 | SYTOX Green Staining Solution | 20μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1070M-1 | Annexin V-mCherry | 250μl |
| C1070M-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 30ml |
| C1070M-3 | SYTOX Green Staining Solution | 50μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry和SYTOX Green Staining Solution避光保存。
注意事項：
如果有細菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-mCherry，最終導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
