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PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒

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PCR 標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行 PCR,最后得到的 PCR 產(chǎn)物將帶有標(biāo)記,可以直接用于雜交試驗(yàn)。本產(chǎn)品就是基于上述原理的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā),

它具有下列特點(diǎn):

1. 一站式,本試劑盒提供經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑,不需要用戶自己摸索。

2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng))和 5 次 50 uL 體系的標(biāo)記反應(yīng)。

3. 一次標(biāo)記可以得到ug級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針,足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。

4. 既可用于制備雙鏈探針,也可以用于單鏈探針。

5. A 型需自備含標(biāo)記核苷酸的 dNTP, B 和 C 型分別含生物素和地高辛標(biāo)記的底物?捎玫淖詡錁(biāo)記底物包括 fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

6. 摻入率一般為 4-5%,有效降低了空間阻礙,檢測(cè)效果最佳。

7. 標(biāo)記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

8. 本產(chǎn)品足夠 5 次非標(biāo)記 PCR 和 5 次標(biāo)記 PCR(均指 50uL 體系)。

規(guī)格及成分:

運(yùn)輸及保存: 低溫運(yùn)輸,-20℃保存,有效期一年。

自備試劑 :DNA 模板和模板專(zhuān)一性引物。

使用方法 一:準(zhǔn)備工作

1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì) PCR 引物,使探針長(zhǎng)度在 400-800bp 之間。過(guò)短則標(biāo)記參入少,探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱;過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加,背景變強(qiáng)。

2. 由于標(biāo)記的 dNTP 比較珍貴,所以不推薦以基因組 DNA 或其他復(fù)雜 DNA為模板直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記,而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來(lái)提高成功率,即先制備非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物,再以之為模板制備標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物。

3. 對(duì) A 型標(biāo)記試劑盒,四種 10mM 的 dNTP 是分開(kāi)提供,用于制備 50uL非標(biāo)記 dNTP(2mM each,用于非標(biāo)記 PCR,用于制備標(biāo)記 PCR 的模板。配制方法是四種 10mM 的 dNTP 各加 10uL,再加水 10uL 即可)

和 25uL 標(biāo)記 dNTP(2mM each,其中標(biāo)記核苷酸和對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸的比例需要自行優(yōu)化,假如是 biotin 或 DIG 標(biāo)記的是 dUTP,則其對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸是 dTTP,兩者的最佳比例一般為 1:3;如果是BrdUTP,則兩者的最佳比例為 1:1。

配制方法是三種 10mM 的 dNTP各加 5uL,再加標(biāo)記核苷酸和其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記核苷酸使其總的終濃度為2mM,再補(bǔ)水到 25uL)。

二:非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物的制備

4. 設(shè)置50uL非標(biāo)記PCR:2×標(biāo)記專(zhuān)用PCR Mix 25 uL,dNTP Mix(2mMeach)5uL,自備的探針引物(10pmol/uL)各 1uL,1 ug 基因組 DNA或 1ng 質(zhì)粒 DNA,補(bǔ)超純水到 50 uL。

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進(jìn)行常規(guī) PCR。

6. 膠回 PCR 產(chǎn)物并定量,膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR。

三:標(biāo)記 PCR 反應(yīng)(最好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量)

注意:由于雙鏈 PCR 探針在雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性,降低雜交效率,因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR。

成份

樣品

非標(biāo)記對(duì)照

標(biāo)記專(zhuān)用PCR Mix

25 uL

25 uL

A 型:含標(biāo)記核苷酸的dNTP Mix

B 型:含 Biotin-11-dUTP  dNTP C 型:含 DIG-11-dUTP 的 dNTP

 

5 uL

 

不加

dNTP Mix,2mM

不加

5 uL

若單鏈標(biāo)記:加探針引物其一

50 pmol

50 pmol

若雙鏈標(biāo)記:加探針引物一和引物二

 50 pmol

 50 pmol

膠純化所得 PCR 產(chǎn)物(單鏈標(biāo)記可

用 100ng 模板)

10 ng

10 ng

超純水

補(bǔ)到 50 uL

補(bǔ)到 50 uL

 注意:本試劑盒提供的 dNTP 混合物總濃度為 2mM,所含標(biāo)記 dUTP 與非標(biāo)記 dTTP 的比例已經(jīng)進(jìn)過(guò)優(yōu)化。

7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR,但需要進(jìn)行下列修改:一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物,探針對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度完整性要求不高(長(zhǎng)度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),效果反而更好),

所以可以增加循環(huán)數(shù);二是延伸時(shí)間增加 15 秒,因?yàn)闃?biāo)記 dUTP 參入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢;三是降低復(fù)性溫度 5-7℃,因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到 DNA 后,新模板的 Tm 值將降低。

8. 標(biāo)記探針的定量:取標(biāo)記反應(yīng)液和對(duì)照反應(yīng)液 1-5 uL,在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的 DNA marker 一起電泳,并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記產(chǎn)物中額外帶有生物素,地高辛等、其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。下圖是一個(gè)典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖:

注意:如果擴(kuò)增的是單鏈 DNA 探針,其結(jié)合 EB 的能力遠(yuǎn)低于雙鏈 DNA,因此 EB 染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng) DNA 的真實(shí)濃度,可以采用銀染定量(跟marker 比較)。一般 100ng 模板經(jīng)單鏈 PCR 擴(kuò)增可得到 700ng 左右探針。

9. 剩余的 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化,直接加入(對(duì)單鏈 PCR 探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對(duì)雙鏈 PCR 探針)到雜交液中使用。也可放-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要純化,請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法純化。

 

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