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高純質(zhì)粒小提試劑盒

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  試劑盒內(nèi)容及保存:

試劑盒組成

RTP2101-02

100次)

RTP2101-03

200次)

貯存方式

RNase A

300 μl

600 μl

-20

Lysis Dye

600μl

2×600μl

室溫

溶液P1

30 ml

60 ml

室溫

(加入RNase A2-8保存)

溶液P2

30 ml

60 ml

室溫

溶液P3

40 ml

80 ml

室溫

去蛋白液PD

60 ml

120 ml

室溫

漂洗液PW

25 ml

2×25 ml

室溫

洗脫緩沖液EB

15 ml

15 ml

室溫

質(zhì)粒吸附柱CP

100

2×100

室溫

收集管(2 ml

100

2×100

室溫

說明書

1

1

 

 

 儲存條件和效期:

本試劑盒在室溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年;更長時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下,若溶液產(chǎn)生沉淀,應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的RNase A -20℃可穩(wěn)定保存1年以上。加入RNase A后的溶液P1應(yīng)置于2–8℃保存,可穩(wěn)定保存半年。

 

 產(chǎn)品簡介及使用說明:

本試劑盒采用經(jīng)典的堿裂解法裂解細菌,再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合DNA的特性,可以從15ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中快速提取320μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)?蛇m用于各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等實驗。然而,對質(zhì)粒純度要求更高的轉(zhuǎn)染實驗(要求無內(nèi)毒素),此試劑盒不能達到要求。另外,盡管該試劑盒可以抽提較大的質(zhì)粒(>10kb),但我們不推薦使用。如果一定要使用,請參考以下方法:加大菌體使用量(使用5–10 ml過夜培養(yǎng)物),同時按照比例增加P1、P2、P3的用量;洗脫緩沖液應(yīng)在70℃預(yù)熱,在吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間,以增加提取效率,其它步驟相同。

 

 產(chǎn)品特點:

1使用了Lysis Dye,菌體裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經(jīng)驗,所以我們增加了Lysis Dye(一種能使裂解/中和體系變換顏色的試劑)來幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1后,Lysis Dye使菌液變?yōu)闇啙岬募t色;加入P2后,Lysis Dye立即使溶液變?yōu)槌吻宓募t色,裂解是否完全只要觀察紅色溶液是否澄清,如果紅色非常均一,表明裂解充分;在完全裂解的體系中加入P3混勻后,體系立即變?yōu)辄S色,任何紅色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

增加了去蛋白液PD,能更加徹底地去除蛋白污染,得到純度更高的質(zhì)粒。

 準備工作:

將試劑盒附帶的RNase A全部加入到溶液P1中(如15ml P1中加入150μl RNase A),混勻后4貯存。

按照標簽所示在漂洗液PW中加入無水乙醇,混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/span>

每次使用前請檢查溶液P2,溶液P3和去蛋白液PD是否有沉淀生成,如果出現(xiàn)沉淀,37溫浴至沉淀溶解后再使用。

 

 使用Lysis Dye的標準操作步驟:

如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1.   1–5 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中,10,000g 離心1分鐘,盡量吸除上清。

:菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。

2.   向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1請先檢查是否已加入RNaseA)和5μl Lysis Dye,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀,此時溶液為渾濁的紅色。

注:如果有未徹底混勻的菌塊,會影響裂解,導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.   加入250 μl溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次使菌體充分裂解,此時溶液變?yōu)槌吻宓募t色。

溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免污染基因組DNA;所用時間絕對不應(yīng)超過5分鐘 ,以免質(zhì)粒受到破壞;紅色溶液應(yīng)該透明均一,如有渾濁紅色顆粒,表明裂解不充分,會大大降低質(zhì)粒提取效率。

4.   加入350 μl溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn),充分混勻,混勻充分的標志是溶液完全呈透明的黃色,如有可見紅色,說明混勻不徹底。10,000g 離心10分鐘。

注:P3加入后應(yīng)立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。

5.  小心地將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP中(吸附柱放入收集管中)10,000g離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

6.向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD10,000g離心30秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

7.  向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW請先檢查是否已加入無水乙醇),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW,10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液。

9.  將吸附柱CP置于重新放回收集管中,10,000g 離心2分鐘。

:此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,絕對不可省略,因為漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)實驗(酶切,PCR等)。

10. 將吸附柱CP置于一個干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,10,000g 離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,-20保存。

注:● 為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中,再次離心收集。

 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl,體積過小影響回收效率。

 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會降低

洗脫效率。

不使用Lysis Dye的標準操作步驟:

如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1.   1–5 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中,10,000 g離心1分鐘,盡量吸除上清。

菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。

2.   向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1請先檢查是否已加入RNaseA),使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。

注:如果有未徹底混勻的菌塊,會影響裂解,導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.  加入250 μl溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次使菌體充分裂解。

注:溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免污染基因組DNA所用時間絕對不應(yīng)超過5分鐘,以免質(zhì)粒受到破壞。

4.   加入350 μl溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次,充分混勻,此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。10,000g 離心10分鐘。

注:P3加入后應(yīng)立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清。

5.  小心地將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP中(吸附柱放入收集管中),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

6.向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD,10,000g離心30秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

7.   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW請先檢查是否已加入無水乙醇),10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP重新放回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW10,000g 離心30–60秒,倒掉收集管中的廢液。

8.  將吸附柱CP置于收集管中,10,000g 離心2分鐘。

:此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,絕對不可省略,因為漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)實驗(酶切,PCR等)。

9.   將吸附柱CP置于一個干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,10,000g離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,-20保存。

注:● 為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中,再次離心收集。

 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl,體積過小影響回收效率。

 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會降低洗脫效率。

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