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植物硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒

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 ● 產(chǎn)品組成:

 

組分貨號

名稱

規(guī)格

貯存

運(yùn)輸

PN5040-01

試劑1-NR誘導(dǎo)劑(50×)

10 ml

4

RT

PN5040-02

試劑2-NR提取緩沖液(2×)

25 ml

4

RT

PN5040-03

試劑3-NR分析緩沖液

25 ml

4

RT

PN5040-04

試劑4-NADH10×)

1.2 ml

-20

RT

PN5040-05

試劑5-顯色液1

15 ml

4

RT

PN5040-06

試劑6-顯色液2

15 ml

4

RT

PN5040-07

試劑7-標(biāo)準(zhǔn)液(100×)

1 ml

-20

RT

DT0140P

1M DTT

1 ml

-20

RT

● 產(chǎn)品簡介:

硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR,EC1.7.1.3)廣泛存在于植物中,是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶,它的活性高低直接影響到植物對土壤中硝態(tài)氮素的利用,影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶,通常在有 NO3-存在時,會誘導(dǎo)硝酸還原酶的活性。

測定原理:NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ+NADH→ NO2ˉ +NAD++H2O;產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對–氨基苯磺酸α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物; 生成的紅色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰,可用分光光度法測定。

按照每次提取使用1 ml提取緩沖液計算,該產(chǎn)品可以使用45-50次。

● 貯存和效期:

  試劑盒常溫運(yùn)輸;按照標(biāo)簽溫度貯存;開封使用后有效期一年。

● 自備材料:

植物根莖、葉子等;剪刀;離心管;分光光度計;水浴鍋;離心機(jī);1ml比色皿

● 操作步驟:

用前必讀:由于不同材料NR活性差距較大,首次實(shí)驗(yàn)時建議取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

準(zhǔn)備30度水;分光光度計調(diào)節(jié)到540nm,開機(jī)預(yù)熱30分鐘。

、 樣本處理:

1. 樣品的誘導(dǎo)前處理:

將NR誘導(dǎo)劑(50×)用蒸餾水稀釋50倍,如取49 ml蒸餾水加入1 ml 誘導(dǎo)劑。 將植物樣品浸泡于誘導(dǎo)劑中,浸泡2小時。

注:如未經(jīng)誘導(dǎo),植物體內(nèi)NR活性很低,預(yù)測定結(jié)果沒有活性(OD測定管OD對照管)則需要誘導(dǎo)處理。

、 硝酸還原酶提。

2. 即用型NR提取緩沖液配制:

 

一個反應(yīng)配制體積 1 ml

n個反應(yīng)配制體積 n×1 ml

試劑2-NR提取緩沖液(2×)

0.5 ml

n×0.5 ml

1 M DTT100×

10 μl

n×10 μl

滅菌水

0.49 ml

n×0.49 ml

注:配制好的即用型NR提取緩沖液可以4℃短期保存一周;

3. NR提取步驟

取誘導(dǎo)后的樣品或新鮮植物組織,清洗干凈,擦干,液氮中研磨,1 cm2葉片(1分硬幣大小)或0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型NR提取緩沖液,顛倒混勻, 12000rpm4℃離心 5分鐘,上清即為NR提取液,冰浴放置備用。

注:NR提取液最好立即測定,不建議保存。

、硝酸根還原步驟:

4. 即用型標(biāo)準(zhǔn)液配制:

取試劑7-標(biāo)準(zhǔn)液(100×)稀釋100倍,即取10 μl加990μl滅菌水中,混勻,即用型標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 μmol/ml(100 μM)。

5. 即用型NADH配制:

   根據(jù)標(biāo)簽所示加入超純水配制試劑4-NADH(10×),稀釋10倍,如取100 μl加900 μl滅菌水,混勻,冰浴備用。

6. 參考下表設(shè)置檢測反應(yīng)體系,按照順序在1.5ml離心管中依次加入試劑(單位μl):

加入順序

 

1#測定管

2#對照管

3#標(biāo)準(zhǔn)管

4#空白管

1

NR提取液(樣本)

100

100

-

-

2

即用型標(biāo)準(zhǔn)液 0.1 μmol/ml(100 μM)

-

-

100

-

3

蒸餾水

-

125

-

125

4

試劑3-NR分析緩沖液

375

375

375

375

5

即用型NADH

125

-

125

-

6

 

30度水浴0.5小時

7

試劑5-顯色液1

250

250

250

250

8

試劑6-顯色液2

250

250

250

250

9

 

混勻,常溫顯色0.5 小時

四、計算:

7. 用蒸餾水調(diào)零分光光度計,取1ml加到比色皿中,分別測定各管在540nm的吸光值,記錄讀數(shù)。

NR單位定義(Units):每小時每克鮮重樣品中催化產(chǎn)生1μmol NO2-的量為一個NR活力單位。

NR活性(μmol/h/g FW)=(測定OD-對照OD)/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.1 μmol/ml)×(取樣體積0.1 ml)/(樣品鮮重g×反應(yīng)時間0.5 h)×樣品測定前稀釋倍數(shù)(如0.1g葉片用1ml提取緩沖液,即稀釋10倍)

此公式整理為:NR活性(μmol/h/g FW=0.2/FW×(測定OD-對照OD/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD

8. 計算舉例:

0.1克植物鮮重材料使用1 ml提取緩沖液提取:稀釋倍數(shù)為10

測定OD=0.159 對照OD=0.121 標(biāo)準(zhǔn)OD=0.16 空白OD=0.004

NR 活性(μmol/h/g FW)=0.2/0.1×(0.159-0.121)/(0.16-0.004)=0.012

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