注 意 :正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
H2O2是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子,主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生,由CAT和POD等催化降解。H2O2不僅是重要的活性氧之一,也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面,H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸,蛋白質(zhì)等生物大分子,并使細胞膜遭受損害,從而加速細胞的衰老和解體;另一方面H2O2也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,。
測定原理:
H2O2與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物,在415nm有特征吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、丙酮60mL、濃鹽酸10mL、研缽和冰。
試劑的組成和配制:
試劑一:丙酮60mL×1瓶,4℃保存;(自備)
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入10mL濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑4℃保存;(溶解時間較長,約30min,可40℃-60℃加熱溶解,務(wù)必提前準備)
試劑三:15mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:60mL×1瓶,4℃保存;
H2O2提取:
1、細菌或細胞樣品的制備:收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);用試劑一定容至1mL;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織樣品的制備:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿;轉(zhuǎn)移至EP管中,用試劑一定容至1mL,8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至415nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二、三和四37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
3、 在EP管中按順序加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 吸取的量的為全部上清液 |
|
試劑一 |
| 1000 |
試劑二 | 100 | 100 |
試劑三 | 200 | 200 |
4000g,25℃離心10min,棄上清,留沉淀
試劑四 | 1000 | 1000 |
加入試劑四溶解沉淀后,室溫靜置5min,倒入比色皿中,測定415nm處吸光值A。對照管只要做一次即可。計算ΔA=A測定-A對照。
注意事項:
1、由于試劑一易揮發(fā),試劑一必須先預(yù)冷再加,研磨時必須在冰上研磨。
2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高,請帶一次性手套和口罩。
H2O2含量計算:
1、標準條件下測定的回歸曲線,y = 0.7488x + 0.0006 (x為標準品濃度,μmol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)中H2O2含量的計算:
H2O2含量(μmol/mL)=(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)
3、細菌、細胞或組織中H2O2含量計算
(1)按照蛋白濃度計算
H2O2含量(μmol/mg prot)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
(2)按照樣本質(zhì)量計算
H2O2含量(μmol/g鮮重)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W
(3 ) 按照細菌或細胞密度計算:
H2O2含量(μmol/104)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,1mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。
注意:標曲線性范圍為0.1μmol/mL到2μmol/mL,吸光度ΔA線性范圍為0.07-1.5,若ΔA超過1.5則需要稀釋,計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。