組織微環(huán)境中有復(fù)雜的細胞組成，這些細胞的表型、狀態(tài)、豐度、分布都有著重要的生物學意義和臨床價值。借助抗體染色可以將其在組織原位上呈現(xiàn)出來。免疫組化染色是一種研究組織形態(tài)和原位蛋白表達的常見技術(shù)，常規(guī)IHC檢測只能展示單一指標，難以呈現(xiàn)復(fù)雜的組織微環(huán)境中的細胞組成、狀態(tài)和關(guān)系，而這些信息對疾病的診斷和治療至關(guān)重要！
酪氨信號放大技術(shù)原理：類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗，HRP催化加入體系的熒光素底物，生產(chǎn)活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的抗體，在換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標記。
產(chǎn)品組分：*表示可選組分，下單前需要確認備注到訂單
產(chǎn)品組分：*表示可選組分，下單前需要確認備注到訂單
| 名 稱 | 規(guī)格(100T) | 保存溫度 | 激發(fā)波長（nm） | 發(fā)射波長（nm） |
| SuperNova488（200x）*A | 50ul | -20℃ | 490 | 515 |
| SuperNova532（200x）*B | 50ul | 527 | 558 | |
| SuperNova555（200x）*C | 50ul | 555 | 565 | |
| SuperNova594（200x）*D | 50ul | 593 | 614 | |
| SuperNova620（200x）*E | 50ul | 617 | 639 | |
| SuperNova640（200x）*F | 50ul | 642 | 662 | |
| SuperNova680（200x）*G | 50ul | 681 | 698 | |
| DAPI（100*母液） | 100ul | 2-8℃ | 360 | 461 |
| 信號放大液 | NA | |||
| 羊抗小鼠二抗(三選一） *H | NA | |||
| 羊抗兔二抗（三選一） *I | NA | |||
| 鼠兔通用二抗（三選一）*J | NA | |||
| 抗熒光淬滅封片劑 | 5mlx2 |
應(yīng)用
主要用于人源或小鼠組織、石蠟切片、TMA芯片的免疫組化染色。
使用方法
樣本要求：
1. 福爾馬林固定的蠟塊或玻片，大塊組織或TMA，封蠟不能有明顯的破損。
2. 玻片樣本，組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。
3. 組織最小應(yīng)包含大于1000 個細胞。
4. 蠟塊需包埋實體瘤組織，壞死瘤組織、細針穿刺物、細胞甩片樣品會影響染色效果。
5. 組織應(yīng)當用10%中性福爾馬林固定，正常固定時間為18～24 小時。
6. 切片厚度為4um 左右，使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內(nèi)制備為佳。
7. 不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，樣本應(yīng)置于玻片正面、中央。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴。
8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，確保水分去除、貼片牢固。
試劑準備：
1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl （pH 7.5），150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)
2) 抗原修復(fù)液：根據(jù)一抗選擇檸檬酸鈉或者EDTA修復(fù)液
3) 抗體稀釋液：可做抗體稀釋和封閉使用，即用型
4) 一抗工作液：現(xiàn)用現(xiàn)配，根據(jù)預(yù)實驗條件優(yōu)化濃度
5) 二抗工作液：二抗工作液為HRP-羊抗鼠兔或兔雙抗
6) 熒光染料染色工作液：系列單色熒光染料為200X 母液，使用前用TSA 信號放大反應(yīng)液1:
200 稀釋用配好的工作液4℃保存，僅限當天使用。
7) DAPI 工作液：DAPI 使用無菌水按1：100稀釋制備工作液
操作步驟：建議采用實驗操作表格進行記錄
1. 樣品脫蠟準備：
a) 溫箱設(shè)置到55℃-60℃，烤片1h 以上。
b) 新鮮二甲苯浸片10min，重復(fù)3 次。
c) 梯度乙醇浸片：100% 3min；95% 3min；70% 3min。
d) 滅菌水洗片1min，重復(fù)3 次。
2. 多重熒光免疫組化染色步驟(A、B、C 三種抗體為例) ：
A 抗體
A.1 抗原修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min 煮沸，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱15min 后冷卻至室溫。進行該步驟之前建議不放樣品進行一次預(yù)實驗，檢測15min 后液面是否高于樣品，避免干片，抗原修復(fù)液不能2 次使用。
A.2 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
A.3 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋A 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.4 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.5 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.6 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率）繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
B 抗體
B.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
B.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋B 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.5 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
C 抗體
C.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
C.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋C 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.5 微波修復(fù)：把1X 堿性抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
每輪染色結(jié)束后可用熒光顯微鏡確認染色情況，注意用TBST 覆蓋樣品，防止干片。
3. DAPI 復(fù)染及封片：
去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI 工作液，室溫孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分鐘，用滅菌水洗片2 分鐘， 在樣品上滴加適量抗淬滅封片劑，加蓋玻片，小心排除氣泡，用透明指甲油封住蓋玻片四周，室溫晾干，4℃ 避光保存。
4. 成像：
選用成像設(shè)備按照染料光譜條件設(shè)置拍攝條件，對染色后的組織片在熒光顯微鏡下數(shù)據(jù)并進行
判讀分析。
1. 福爾馬林固定的蠟塊或玻片，大塊組織或TMA，封蠟不能有明顯的破損。
2. 玻片樣本，組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。
3. 組織最小應(yīng)包含大于1000 個細胞。
4. 蠟塊需包埋實體瘤組織，壞死瘤組織、細針穿刺物、細胞甩片樣品會影響染色效果。
5. 組織應(yīng)當用10%中性福爾馬林固定，正常固定時間為18～24 小時。
6. 切片厚度為4um 左右，使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內(nèi)制備為佳。
7. 不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，樣本應(yīng)置于玻片正面、中央。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴。
8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，確保水分去除、貼片牢固。
試劑準備：
1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl （pH 7.5），150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)
2) 抗原修復(fù)液：根據(jù)一抗選擇檸檬酸鈉或者EDTA修復(fù)液
3) 抗體稀釋液：可做抗體稀釋和封閉使用，即用型
4) 一抗工作液：現(xiàn)用現(xiàn)配，根據(jù)預(yù)實驗條件優(yōu)化濃度
5) 二抗工作液：二抗工作液為HRP-羊抗鼠兔或兔雙抗
6) 熒光染料染色工作液：系列單色熒光染料為200X 母液，使用前用TSA 信號放大反應(yīng)液1:
200 稀釋用配好的工作液4℃保存，僅限當天使用。
7) DAPI 工作液：DAPI 使用無菌水按1：100稀釋制備工作液
操作步驟：建議采用實驗操作表格進行記錄
1. 樣品脫蠟準備：
a) 溫箱設(shè)置到55℃-60℃，烤片1h 以上。
b) 新鮮二甲苯浸片10min，重復(fù)3 次。
c) 梯度乙醇浸片：100% 3min；95% 3min；70% 3min。
d) 滅菌水洗片1min，重復(fù)3 次。
2. 多重熒光免疫組化染色步驟(A、B、C 三種抗體為例) ：
A 抗體
A.1 抗原修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min 煮沸，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱15min 后冷卻至室溫。進行該步驟之前建議不放樣品進行一次預(yù)實驗，檢測15min 后液面是否高于樣品，避免干片，抗原修復(fù)液不能2 次使用。
A.2 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
A.3 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋A 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.4 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.5 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
A.6 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率）繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
B 抗體
B.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
B.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋B 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
B.5 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
C 抗體
C.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。
C.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋C 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至完全覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。
C.5 微波修復(fù)：把1X 堿性抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火（約20%功率） 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。
每輪染色結(jié)束后可用熒光顯微鏡確認染色情況，注意用TBST 覆蓋樣品，防止干片。
3. DAPI 復(fù)染及封片：
去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI 工作液，室溫孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分鐘，用滅菌水洗片2 分鐘， 在樣品上滴加適量抗淬滅封片劑，加蓋玻片，小心排除氣泡，用透明指甲油封住蓋玻片四周，室溫晾干，4℃ 避光保存。
4. 成像：
選用成像設(shè)備按照染料光譜條件設(shè)置拍攝條件，對染色后的組織片在熒光顯微鏡下數(shù)據(jù)并進行
判讀分析。
是否允許進口
允許
是否危險品
非危險品
性能
供應(yīng)商
Absin
存放說明
熒光染料需避光保存，按說明書要求，收到貨起有效期為12個月。
參考文獻
1.Dabbs David J. 診斷免疫組織化學(M). 北京：北京大學醫(yī)學出版社，2008.9. 2.【美】Ed Harlow, David Lane. 抗體技術(shù)指南(M). 北京：科學出版社，2002:79-80,105. 3.Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58. 4.錢幫國. 焦磊. 多標記免疫熒光染色及多普成像技術(shù)在組織學研究中的應(yīng)用. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2017 (4): 373-382.
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