注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
幾丁質(zhì)酶（Chitinase）試劑盒微量法測(cè)定意義：
幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，
以及真菌類的細(xì)胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的
作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。
測(cè)定原理：
幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與對(duì)二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、甲苯（土壤樣品專用）和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 105mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
粗酶液提�。�
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，
加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液：直接測(cè)定。
測(cè)定操作表：
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至585nm，對(duì)照管調(diào)零。
2、操作表
|
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
| 粗酶液（µL） | 80 | 80 |
| 提取液（µL） | 120 | 40 |
| 試劑一（µL） |
| 80 |
| 混勻，37℃水浴 1h，5000rpm，4℃，離心 10min，取上清。 | ||
| 試劑二（µL） | 40 | 40 |
| 混勻，沸水浴 7min | ||
| 試劑三（µL） | 40 | 40 |
| |
|
|
| 試劑四（µL） | 80 | 80 |
| 混勻，37℃，15min，于微量石英比色皿/96 孔板，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 A 585 。 | ||
計(jì)算公式：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.3575x-0.0143，R2=0.9989
計(jì)算公式：
1、 按照樣本重量計(jì)算
酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g）= (A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=1.91×（A 585 +0.0143）÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g
2、 按照蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mg prot）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣×Cpr)
=1.91×（A 585 +0.0143）÷ Cpr
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；
3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
細(xì)胞幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/104cell）=(A585+0.0143)÷2.3575×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)=1.91×（A 585 +0.0143）÷細(xì)胞數(shù)量
4、按照液體體積計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶
量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mL）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷V 樣=1.91×（A 585 +0.0143
b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.1788x-0.0143，R2=0.9989
計(jì)算公式：
1、按照樣本重量計(jì)算
酶活性定義：37℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量
為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/g）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=3.82×（A 585 +0.0143）÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g2、按照蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量
為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mg prot）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣×Cpr)
= 3.82×（A 585 +0.0143）÷ Cpr
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.36mL；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.08mL；Cpr：蛋白濃度，
mg/mL；
3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/104cell）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=3.82×（A 585 +0.0143）÷細(xì)胞數(shù)量
4、按照液體體積計(jì)算
酶活定義：37℃條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶
量為一個(gè)酶活單位。
幾丁質(zhì)酶活性（mg/h/mL）=(A585+0.0143) ÷2.3575×V 反總÷V 樣= 3.82×（A 585 +0.0143）
注意事項(xiàng)：
1、 反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行比色。
2、 OD 值大于 0.8，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)；或者縮短 37℃水浴時(shí)間到 x 小時(shí)（如 0.5 小時(shí)），按照原先計(jì)算公式得到的結(jié)果再除以 x。
3、 試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。
