注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
羥自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等生物分子,造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損,進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾病。羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一,在抗氧化類(lèi)保健品和藥品研究中得到廣泛應(yīng)用。
測(cè)定原理:
H2O2/ Fe2+ 通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,將鄰二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+ ,導(dǎo)致536nm吸光度下降,樣品對(duì)536nm吸光度下降速率的抑制程度,反映了樣品清除羥自由基的能力。
自備實(shí)驗(yàn)用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體50 mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體16mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體8 mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體16mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體9mL×1瓶,4℃保存。
樣品的制備:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2. 血清、果汁等液體樣品可直接測(cè)定。
3. 提取物(或者藥物)可配制成一定濃度,如5 mg/mL。
操作步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至536nm,蒸餾水調(diào)零。
2、工作液配制:使用之前按照每管試劑一:試劑二:試劑三=300:150:300(µL)的比例配制,用多少配多少,混勻。
3、在EP管中加入如下試劑
| 空白管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
工作液(µL) | 750 | 750 | 750 |
混勻,防止局部顏色過(guò)濃 | |||
樣品(µL) |
|
| 150 |
試劑四(µL) |
| 150 | 150 |
H2O(µL) | 300 | 150 |
|
混勻、37℃保溫60min,8000g 25℃離心5min,吸取1mL于1mL玻璃比色皿中測(cè)定536nm處吸光值,空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值分別記為A空、A對(duì)和A測(cè)。 |
注意:空白管和對(duì)照管只需測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
羥自由基清除率 D% =(A測(cè)-A對(duì))÷(A空-A對(duì))×100%
A空、A對(duì)、A測(cè):空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值。