偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV) 會(huì)引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬最為敏感，15日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型，主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，最后昏迷死亡；育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高，呼吸困難，一般不發(fā)生死亡，耐過后呈長(zhǎng)朗隱性感染帶毒或排毒；成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高，一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期，可在感染后的20天左右發(fā)生流產(chǎn)，在妊娠后期，經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊，或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū)，偽狂犬病被認(rèn)為是對(duì)經(jīng)濟(jì)影響最大的豬病毒病，因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)偽狂犬病病毒保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
| 成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR MagicMix | 90408 | 500μL（棕色管） |
| 熒光PCR專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
| 偽狂犬病病毒PCR引物混合物 | 14-35100yw | 100μL（白蓋） |
| 偽狂犬病病毒PCR陽性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 14-35100pc | 50μL（紅蓋） |
| DNA病毒裂解液（試用裝） | 3674a | 15次（9 mL） |
| 使用手冊(cè) | 14-35100sc | 1份 |
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。 |
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| 自備試劑 | DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。 |
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| 使用方法 | 一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例） 1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。 2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。 3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。 4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。 5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。 6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。 7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。 二、樣品DNA的制備 8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢杂�10μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。 9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒DNAout或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送15次一管式病毒DNAout，其使用手冊(cè)可從本公司網(wǎng)站www.tiandz.com通過搜索產(chǎn)品名稱一管式病毒DNAout或產(chǎn)品編號(hào)3674下載。 三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行） 10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。 11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。 12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，最大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的最大吸收光譜在500 nm，最大發(fā)射光譜在530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。 四、數(shù)據(jù)處理 14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。 15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。 |
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