產(chǎn)品及特點(diǎn)
植物線粒體是重要的植物細(xì)胞器，負(fù)責(zé) ATP 的產(chǎn)生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟線粒體相關(guān)，是母系遺傳研究的重要材料。對(duì)植物線粒體進(jìn)行遺傳研究需要進(jìn)行線粒體DNA 純化。本產(chǎn)品就是專(zhuān)門(mén)用于植物細(xì)胞線粒體DNA 純化的試劑盒， 它具有下列特點(diǎn)：
1.即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。
2.提供粗提和精提兩種操作方案，粗提利用常規(guī)臺(tái)式冷凍離心機(jī)的差速分離原理進(jìn)行線粒體粗提，所得線粒體含少量其他細(xì)胞器污染，可用于后續(xù)的 PCR 級(jí)別的線粒體 DNA 提取。
3.精提利用冷凍超速離心（離心力達(dá) 40000g）制備的密度梯度來(lái)將粗提制備的線粒體和其他細(xì)胞成分進(jìn)一步分開(kāi)，得到線粒體精提液，適用于后續(xù)的測(cè)序級(jí)別的線粒體 DNA 提取。
4.本產(chǎn)品足夠 5 次提取，每次可處理 10g 綠色植物組織（可得 1-2.5 mg 左右線粒體）或 20g 非綠色植物組織（可得 2-5 mg 左右的線粒體）。
試劑盒組成：
| 成分 | 編號(hào) | 大紙盒包裝 |
| 植物線粒體提取勻漿液 | 111208a | 250 mL |
| 植物線粒體提取洗滌液 | 111208b | 250 mL×2 |
| 植物線粒體提取離心介質(zhì)溶液 | 111208c | 150 mL |
| Percoll | 17-0891-09 | 50 mL |
| BSA 干粉 | 9048-46-8 | 10g |
| 帶柄尼龍篩 | 111208d | 1 個(gè) |
| 軟毛筆 | 111208e | 1 只 |
| 詹納斯綠 B 染色液（0.2%） | 111207d | 1 mL |
| DNase A 干粉 | 101004a | 1 mg |
| 細(xì)胞器 DNA 純化溶液 A | 180702a | 3 mL |
| 細(xì)胞器 DNA 純化溶液 B | 180702b | 750 uL |
| 使用手冊(cè) | 180702sc | 1 份 |
運(yùn)輸及保存常溫運(yùn)輸和保存, 保存期限一年。
自備試劑超純水、5 M KOH（調(diào) pH 用），25mM MgCl2 溶液、0.5M EDTA 溶液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、TE 緩沖液或超純水。
使用方法
注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用植物組織，器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。任何情況下線粒體的溫度都不要超過(guò) 4℃。一：選擇植物組織
1.植物組織不同，線粒體產(chǎn)率不同，請(qǐng)以下表為參考：
| 植物組織種類(lèi) | 線粒體產(chǎn)率 | 說(shuō)明 |
| 根和塊莖 | 0.3 mg/10g | 如土豆，紅薯等 |
| 黃化苗（下胚軸、子葉、胚芽鞘） | 2-5 mg/10g | 多酚含量低于葉片 |
| 有光合作用的葉片和子葉 | 1-2.5 mg/10g | 需放置在暗處 3 天 |
2.一般純化最好選用黃化苗。如果用綠色組織（如葉片），需將植物提前放在暗室至少 3 天以降低淀粉含量，否則淀粉顆粒將干擾線粒體的純化。
3.一次實(shí)驗(yàn)需要 10g 綠色植物組織（或 20 g 干凈的非綠色植物組織）、40 mL 勻漿液、約 90 mL 洗滌液和 35 mL 密度梯度離心介質(zhì)（密度梯度離心介質(zhì)的配制方式是一次性將 9.8g =8.7mLPercoll 加入到 26.3mL 本試劑盒提供的離心介質(zhì)溶液中，充分混勻后得到 35mL 密度梯度離心介質(zhì)）。上述三種溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其終濃度為 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，輕柔顛倒混勻或攪拌溶解后放冰上預(yù)冷待用）。每次實(shí)驗(yàn)用多少配多少，不要預(yù)先將所有BSA 干粉加入，否則容易長(zhǎng)菌。
二：線粒體粗提操作流程
4.將 10 g 的綠色植物組織（去葉脈后的嫩葉子、愈傷組織）或 20 g 干凈的非綠色植物組織（如發(fā)芽組織、根、塊莖等）浸泡在冰水中 10 分鐘，取出用紙吸干液體后浸泡在預(yù)冷的 40 mL 勻漿液（已加 0.1% BSA）中，在浸泡狀態(tài)下剪成 1cm2大小的碎片。注意：處理樣品量太大的話線粒體產(chǎn)率會(huì)急劇降低，所以如果同一樣品太多可分成多組平行處理，得到線粒體粗提物后再匯集，
5.將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿器中，中速勻漿 3 次，每次15 秒，每次之間間隔 10 秒以便讓碎片沉淀到刀片處。也可使用研磨法，具體操作是將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的研缽中，研磨 3-4 分鐘。注意： 植物組織勻漿后釋放的物質(zhì)會(huì)使勻漿液酸化，降低 pH，而線粒體對(duì) pH 變化非常敏感，因此建議勻漿后用 pH 試紙檢測(cè)勻漿液的pH，如果低于 7.0，必須用自備的 5 M KOH 將pH 調(diào)到 7.0 以上才進(jìn)入下一步。
6.用帶柄尼龍篩過(guò)濾勻漿液，穿透液可通過(guò)預(yù)冷的漏斗收集到預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中。帶柄尼龍篩可以洗干凈后可以反復(fù)使用。
7.在低速固定角度冷凍離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，沉淀為未破碎的細(xì)胞、破碎細(xì)胞的碎片、細(xì)胞核和淀粉顆粒，上清含線粒體。小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷的 50mL 塑料離心管中。
8.將裝上清的離心管在水平冷凍離心機(jī)上 4℃ 12,000 g離心 20 分鐘，棄上清
液，所得棕綠色沉淀即為純化的線粒體粗提物。有時(shí)沉淀底部還有白色的淀粉沉淀，屬于正�，F(xiàn)象。
9.加入 10 mL 預(yù)冷的洗滌液（已加 0.1% BSA，下同）中，用軟毛筆輕柔重懸線粒體沉淀。不能劇烈震蕩，否則線粒體容易破裂。
10.將線粒體重懸液轉(zhuǎn)移到新的 50mL 離心管中，再加入 30mL 預(yù)冷的洗滌液，4℃ 1000 g 離心 5 分鐘。線粒體將在上清中。
11.將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000 g離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。小心棄上清。到此步時(shí)，線粒體回收率一般在 15-30%。
12.在沉淀中加入 2 mL 預(yù)冷的洗滌液。用軟毛筆輕柔重懸，得到線粒體粗提液。如果有平行提取，可將最多 4 管線粒體沉淀重懸在 2 mL 洗滌液中。線粒體粗提液中線粒體的回收率一般在 45-75%。
13.在顯微鏡下檢測(cè)上一步重懸液中線粒體的完整性。具體做法是先滴 50uL 左右的線粒體重懸液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。
14.所得線粒體粗提液含其他細(xì)胞器（如類(lèi)囊體膜, 質(zhì)體, 過(guò)氧化物酶體， 乙醛酸循環(huán)體,或細(xì)菌）污染，但可直接用于 PCR 級(jí)線粒體 DNA 和 RNA 的提取。如果需要長(zhǎng)期保存，則直接放-80℃保存。如此保存的線粒體 DNA 完整性在幾年內(nèi)都不會(huì)發(fā)生變化。
三：細(xì)胞核 DNA 的去除（純化測(cè)序級(jí)的線粒體 DNA 才需要進(jìn)行此操作）
15.預(yù)留 50uL 線粒體粗提液做對(duì)照，在約 2 mL 剩余的線粒體粗提液中加入 40 uL 25mM 自備的 MgCl2，再加入 0.2mg DNase 干粉，混勻后冰上放置 60 分鐘降解 DNA。取少量樣品（如 50uL）在 PCR 儀器中加熱到 95℃變性 10 分鐘滅活 DNase，再取其中的 10uL 和 10uL 預(yù)留的樣品一起進(jìn)行細(xì)胞核基因?qū)Ｒ恍訮CR（需要用戶自己設(shè)計(jì)引物和自備 PCR 試劑），如果 DNase 處理過(guò)的樣品沒(méi)有擴(kuò)增，而預(yù)留樣品有擴(kuò)增，則表明 DNA 去除比較干凈（到 PCR 檢測(cè)的極限），則進(jìn)入下一步。如果未去除干凈，則繼續(xù)在冰上放置，直到 PCR 檢測(cè)不到細(xì)胞核 DNA。
16.加入 0.32 mL 預(yù)冷的自備 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 預(yù)冷的洗滌液。
17.4℃ 1000 g離心5 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的50mL 離心管中，4℃ 12000 g 離心 20 分鐘，沉淀為去除細(xì)胞核 DNA 的線粒體。重懸在 2mL 洗滌液中。
18.在顯微鏡下檢測(cè)上一步得到的重懸液中線粒體的完整性。具體做法是先滴 50uL 左右的線粒體重懸液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B 染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。
四：線粒體精提操作方案（需要 40000g 的超速冷凍離心機(jī)）
19.在 50 mL 預(yù)冷的塑料離心管中先后加入 35 mL 預(yù)冷的密度梯度離心介質(zhì)（配制方法見(jiàn)第三步，用前需先加 0.1% BSA）。
20.將 2 mL 線粒體粗提物重懸液鋪在密度梯度離心介質(zhì)上。
21.在超速水平離心機(jī)上 4℃ 40,000 g 離心 45 分鐘，最上層為黃色或橙色的質(zhì)體帶（如果材料是綠色植物，此帶將是綠色），其下的白色不透明的帶即為線粒體，管底沉淀為過(guò)氧化物酶體。其示意圖如下：
22.用廣口吸管（可將 1 mL 藍(lán)搶頭中間剪斷后使用）收集線粒體帶，注意避開(kāi)其上的質(zhì)體帶過(guò)氧化物酶體沉淀，估計(jì)所取含線粒體溶液的體積。
23.在 15-20 分鐘的時(shí)間內(nèi)緩慢加入至少 4 倍體積的預(yù)冷的洗滌液。
24.轉(zhuǎn)入 50 mL 塑料管離心管中，在冷凍離心機(jī)上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體�？梢灾苯舆M(jìn)入第 25 步進(jìn)行 DNA 提取。如果暫時(shí)不提取 DNA，則把線粒體沉淀放-80℃保存。
五：線粒體 DNA 的提取
25.在線粒體沉淀中加入 600 uL 65℃預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 提取溶液 A，用移液槍充分吹打均勻。
26.再加入 150 uL 65℃預(yù)熱的細(xì)胞器 DNA 提取溶液 B，顛倒數(shù)次混勻。此時(shí)溶液中可能有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。由于溶液 B 比較粘稠，可以采取稱(chēng)量方法取用， 150 uL 約等于 150-160 mg。也可以將 1 mL 槍頭剪去一截再吸取。
27.65℃放置 5 分鐘。不能室溫放置，否則 DNA 產(chǎn)量會(huì)降低 10-20%。
28.加入 200 uL 自備氯仿，渦旋震蕩混勻 30 秒，此時(shí)溶液將呈乳白色。
29.14000 g 室溫離心 2 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中，避免觸及中間層的白膜。
30.加入 1 倍體積(約 750 uL)的異丙醇到上清液中，用手上下顛倒 30 秒混勻。此時(shí)一般將有絮狀 DNA 沉淀出現(xiàn)。
31.14000 g 室溫離心 3 分鐘。此時(shí)管底將有微小 DNA 沉淀，小心棄上清，注意不要丟棄 DNA 沉淀。
32.在離心管中加 1 mL 75%乙醇，短暫震蕩，14000 g 室溫離心 3 分鐘，棄上清。
33.重復(fù)上述 75%乙醇洗滌操作一次。
34.短暫離心，小心吸棄殘留的液體（約 50 µL）。此步不要省略，否則殘留的液體（含乙醇）將會(huì)影響 DNA 電泳、酶切很 PCR 等反應(yīng)。
35.立即加入 50-100 µL TE 緩沖液或超純水充分溶解線粒體 DNA 沉淀。直接取 5-10 uL 電泳檢測(cè) DNA，再測(cè) OD 計(jì)算濃度和純度，其余樣品放-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/span>
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