TRAP-銀染法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品信息：Kim 于 1994 年借助 PCR 技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測(cè)方法——端粒
重復(fù)片段擴(kuò)增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。本產(chǎn)
品是在其方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行適當(dāng)改良，開(kāi)發(fā)出來(lái)的研究用試劑盒。
本品與通常的端粒酶活性測(cè)定法相比較，具有以下特征：
1、內(nèi)標(biāo)與端粒酶提取液在同一管里進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
2、提供了陽(yáng)性對(duì)照，可以更加準(zhǔn)確地判定陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3、優(yōu)化了引物設(shè)計(jì)，使 PCR
效果進(jìn)一步提高。
使用須知：本試劑盒為研究用試劑，不能將其作為診斷或臨床檢測(cè)試劑使用。
背景知識(shí)：端粒酶是合成染色體末端的端粒的酶。端粒（
telomere）是真核細(xì)胞
染色體的天然末端，由上千個(gè) 6 堿基重復(fù)序列(TTAGGG)組成，是細(xì)胞必需的遺傳 組分，它的作用是維持端粒有足夠的長(zhǎng)度，保證基因信息在復(fù)制過(guò)程中的準(zhǔn)確性， 以防止染色體末端遺傳信息的丟失。在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞分裂周期都會(huì)使端 粒變的越來(lái)越短，當(dāng)端粒短到一定程度時(shí)就會(huì)發(fā)出信號(hào)，細(xì)胞停止分裂。 端粒酶由 RNA 和蛋白質(zhì)亞基組成，是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞染色體 復(fù)制過(guò)程中，能夠以自身 RNA 為模板，在染色體 3’末端合成重復(fù)序列，維持端 粒的長(zhǎng)度。端粒酶在正常體細(xì)胞中的活性被抑制，但是大量的資料表明在一些惡 性腫瘤中的表達(dá)高達(dá) 85%。 由于端粒酶特異地表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞，并且是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂所 需的。因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)。
基本原理：利用端粒酶在體外可以以其自身 RNA 的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核
苷酸鏈的末端添加 6 個(gè)堿基的重復(fù)序列的特性，采用 PCR 方法擴(kuò)增此重復(fù)序列，
并進(jìn)而用聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳顯示 6 個(gè)堿基差異的梯帶。1994 年 Kim 建立的 TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一個(gè) 18nt 的 TS 做上游引物，端粒 酶結(jié)合 TS 末端的 GTT 并合成 AGGGTTAG，然后每經(jīng)過(guò)一次轉(zhuǎn)位合成一個(gè) ggttag 的 6 堿基重復(fù)序列，端粒酶滅活后，加入 CX 做下游引物，經(jīng)過(guò)多次變性-退火- 延伸，擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物。
TBD-PCR 端粒酶活性檢測(cè)試劑盒基于同樣的的原理，利用銀染技術(shù)檢測(cè)端粒酶 的活性。陽(yáng)性結(jié)果在凝膠電泳上顯示相隔 6bp 的梯狀條帶，條帶的多、寡、深或淺表示端粒酶活性的大小。TRAP-銀染法保留了傳統(tǒng) TRAP 法靈敏度高、特異性強(qiáng)
等優(yōu)點(diǎn)，避免了同位素的放射污染。同時(shí)，還增設(shè)了內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物，提供陽(yáng)性對(duì)照品，
優(yōu)化了引物設(shè)計(jì)，使 PCR 效果進(jìn)一步提高，使之能夠高靈敏的檢測(cè)到細(xì)胞和組織
提取物中端粒酶的活性。
試劑盒組成：
組分
50 次實(shí)驗(yàn)量
操作步驟
1、端粒酶的提取
⑴ 手術(shù)后取下的活組織，立即保存在液氮之中。
⑵ 40～100mg 冷凍（
-70％℃）組織用無(wú)菌眼科手術(shù)剪盡量剪碎，研磨器研磨， 加入 40 ul Lysis buffer（使用前每 ml Lysis buffer 加入 2μl
β-巰基乙醇）； 或 1～2×106 沉淀細(xì)胞直接加入 40µl 預(yù)冷的 Lysis buffer，懸浮細(xì)胞，渦旋振 蕩 10s, 置冰浴中 30min，每間隔數(shù)分鐘渦旋振蕩一次，共 5-6 次。
備注：為了獲取比較理想的端粒酶提取液，建議在一些干硬組織中適當(dāng)加入
Wash buffer。
⑶ 4℃離心（
13000rpm,20min）。
⑷ 移取上清，分裝 3-4 管，每管約 20μl。其中一份樣品用于蛋白質(zhì)濃度定 量，其余迅速冷凍，-70℃保存。021-34661276
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2、PCR 擴(kuò)增(1×25ul)
3、PCR 擴(kuò)增：
⑴ 每管加入Ⅰ液 9μl 及端粒酶提取液 1μl，混勻，30℃反應(yīng) 30min。
⑵ 上述各管 93℃加熱 1min 滅活。
⑶ 向上述各管中加入預(yù)熱至 93℃的Ⅱ液各 13ul，混勻，進(jìn)行第一步擴(kuò)增。
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4、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（所有溶液，用戶(hù)自備）
⑴ 制備 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠（
20ml）。
ddH2O
11.19 ml
36%Acr-1%Bis
5.46 ml
5%TEMED
0.4 ml
10×電泳緩沖液
2 ml
1.25%APS
1 ml
⑵ 取 10ul PCR 產(chǎn)物與 2ul 上樣緩沖液混合后加樣，用 0.5×電泳緩沖液作
為電極緩沖液，180V 電泳 2h。
⑶ 小心剝離凝膠，并置于 50%甲醇、10%醋酸中，固定過(guò)夜。
備注：
① 10×電泳緩沖液：15g Tris 、14g 硼酸和 1.17g EDTA (不帶 2Na)
，
用 ddH2O 定容至 200ml。
② 10×上樣緩沖液：0.01%溴酚蘭、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH6.7)
5、銀染（所有溶液，用戶(hù)自備）
⑴ 將凝膠置于 10%醋酸固定 30min 后用蒸餾水漂洗 3 次，每次 5min;
⑵ 將凝膠置于 0.2g/L 硫代硫酸鈉浸泡 1min, 然后用蒸餾水漂洗 3 次，每
次 30s;
⑶ 將凝膠置于硝酸銀染液中浸泡 30min, 然后用蒸餾水漂洗 30s;
⑷ 將凝膠置于顯影液中顯色 10min 左右直到全部條帶顯色清晰為止；
⑸ 將凝膠置于 5%醋酸中浸泡終止反應(yīng)。
⑹ 選擇適當(dāng)時(shí)機(jī)照相。
備注：
① 硝酸銀染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至 100ml。
② 顯色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸鈉，定容至 100ml。
6 使用凝膠分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析021-34661276
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實(shí)驗(yàn)方法的說(shuō)明
1、端粒酶的提�。憾肆Ｃ副旧碛� RNA
和酶功能基團(tuán)，極其容易被降解、
失活。因此，應(yīng)該按提取細(xì)胞總 RNA
的要求，盡量在低溫條件下，快速操作。
簡(jiǎn)化不必要的反復(fù)洗滌程序，提高提取液的蛋白質(zhì)濃度。小量分裝，盡量避免反 復(fù)凍融。
2、反應(yīng)前，測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度，并稀釋至同一濃度，以保證 端粒酶樣品加入量基本一致。
3、為了讓實(shí)驗(yàn)更具有客觀性，實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)務(wù)必設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照， 本試劑盒提供陽(yáng)性對(duì)照的模板，并提供陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)方法。陽(yáng)性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)方
法：另設(shè)一陽(yáng)性對(duì)照管，以陽(yáng)性對(duì)照模板代替端粒酶提取液加入即可。陰性對(duì)照 的實(shí)驗(yàn)方法：可以把 I 液 II 液混合，每管 24ul 混合液，再加入端粒酶提取液， 混勻后直接在 90℃加熱 10min 滅活，不經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增，直接電泳，以排除樣品 中存在的蛋白質(zhì)對(duì)核酸銀染的干擾。
4、關(guān)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)模板的使用為了便于進(jìn)行各樣品間端粒酶活性的比較，我們 提供了內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物。該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物可以作為模板，用于檢測(cè)端粒酶活性的同一對(duì)引物 進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為：50bp。 該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物的使用有兩種方法：
第一種方法：將內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物以一定量加入到端粒酶樣品之中，用同一對(duì)引物在 同一擴(kuò)增管內(nèi)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增。然后通過(guò)比較電泳圖譜中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物和端粒酶擴(kuò)增 帶的相對(duì)強(qiáng)度，即可達(dá)到相對(duì)定量的目的�？紤]到實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度，并避免 PCR 擴(kuò)增時(shí)的平臺(tái)效應(yīng)，只有當(dāng)端粒酶的模板（與其活性相對(duì)應(yīng)）和內(nèi)標(biāo)的模 板比例相接近時(shí)，方能得到較理想的分析效果。 基于不同來(lái)源樣品的端粒酶的活性不同，需要將高濃度的模板進(jìn)行一系列的 稀釋?zhuān)热缫来蜗♂尀?100、1000、10000、100000、1000000 等倍數(shù)，分別取 ul 與等體積的端粒酶樣品混合后作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物和端 粒酶均能明顯擴(kuò)增的稀釋度用于今后的實(shí)驗(yàn)。此種方法從理論上講更嚴(yán)謹(jǐn)，考慮 到了模板的長(zhǎng)度，擴(kuò)增效果和端粒酶活性的關(guān)系，但是需要客戶(hù)自己摸索最佳條 件。實(shí)驗(yàn)室建議在端粒酶活性比較高的情況下將內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)模板稀釋 105再進(jìn)行擴(kuò)增。
第二種方法：是將我們提供的高濃度內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物，在進(jìn)行電泳時(shí)加入。這樣也 能夠?qū)崿F(xiàn)半定量分析，而且方法簡(jiǎn)單可行。
常見(jiàn)問(wèn)題
1、細(xì)胞提取物中沒(méi)有足夠的端粒酶：在冰浴條件下制備細(xì)胞和組織提取物，盡 量縮短制備時(shí)間，適當(dāng)用較高濃度的端粒酶樣品，減少不必要的操作。
2、端粒酶的反應(yīng)時(shí)間不夠：保證反應(yīng)時(shí)間不少于 20min。
3、所有樣品和陰性對(duì)照都成陽(yáng)性：PCR 殘余污染。PCR 反應(yīng)的每一組分勿重復(fù)使 用保證使用潔凈的 PCR 管和 PCR 試管架
4、同一種組織會(huì)有不同的端粒酶的表達(dá)活性：動(dòng)物本身就有種內(nèi)差，每個(gè)個(gè)體 的端粒酶的表達(dá)活性情況也會(huì)不一樣。同一個(gè)體的不同組織（如睪丸/骨髓）端 粒酶的表達(dá)也不一定相同。同一個(gè)體的同一組織的不同部位端粒酶的表達(dá)情況也 不一定相同。
5、腫瘤組織中沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的端粒酶條帶：腫瘤組織中端粒酶的表達(dá)達(dá) 85%， 也有部分腫瘤組織中沒(méi)有端粒酶的表達(dá)，所以極少數(shù)腫瘤組織中有可能沒(méi)有出現(xiàn) 端粒酶的條帶。
6、陽(yáng)性對(duì)照中看不到梯度：因反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性對(duì)照中的端粒酶失活，所以
應(yīng)注意低溫操作。
7、陰性對(duì)照里有梯度條帶出現(xiàn)：PCR 產(chǎn)物、lysis buffer 及反應(yīng)試劑等交叉污 染，請(qǐng)將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物提取區(qū)域和反應(yīng)試劑配制區(qū)域分開(kāi)。另外請(qǐng)經(jīng)常使用手套。
電泳上樣時(shí)的交叉污染，每次上樣時(shí)更換槍頭。
8、由于熱處理、RNase 處理不充分而引起梯度條帶消失：將要使用的槍頭用 DEPC
水浸泡至少 24 小時(shí)，再進(jìn)行高壓滅菌，烤干；提取樣品所用的玻璃制品、陶瓷
品及手術(shù)器械等經(jīng)烤箱 170℃烘烤 5 個(gè)小時(shí)。
9、端粒酶活性不高：改善端粒酶反應(yīng)條件，適當(dāng)增加端粒酶反應(yīng)時(shí)間，適當(dāng)增
加 PCR 循環(huán)數(shù)（但要避免達(dá)到平臺(tái)效應(yīng)，使非特異性擴(kuò)增大量出現(xiàn)），避免
lysis buffer 的惡化，盡量減少端粒酶樣品反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)操作的指導(dǎo)原則是
快速，低溫。
質(zhì)量檢測(cè)報(bào)告：
產(chǎn)品名稱(chēng)：TRAP-銀染法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（TRAP-Silver Staining Telomerase Detection Kit）
HL-60 細(xì)胞在 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并利用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)電泳檢
測(cè) PCR 產(chǎn)物，呈現(xiàn)陽(yáng)性梯帶，視為合格。
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