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檸檬酸合酶(CS)測試盒微量法

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   意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:                           

CSEC 2.3.3.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,是三羧酸循環(huán)第一個限速酶,是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。


測定原理:

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸;該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。


自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水


試劑組成和配制

試劑一液體25mL×1瓶,-20保存

試劑二液體5mL×1瓶,-20保存;

試劑三液體0.5mL×1-20保存;

試劑四液體28mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1,4保存;

試劑六:粉劑×1-20保存,臨用前加入1.2mL蒸餾水,用不完的試劑仍-20保存;


樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一10uL 試劑三,冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g,4℃離心5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CS(此步可選做)。

⑤ 在步驟④的沉淀加入200uL試劑二2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體CS測定


測定步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

1)在試劑五中加入0.6mL無水乙醇和13mL試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

2測定管:在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑五40μL試劑六,混勻,37℃反應(yīng)15min后立即測定吸光值A1

 

3對照管:在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑四40μL試劑六,混勻,37℃反應(yīng)15min后立即測定吸光值A2

4計算ΔA=A1-A2,每個測定管設(shè)一個對照管。

 

CS活性計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CSnmol/min /g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T=23.8×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CSnmol/min /104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.0475×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,9.6×10-4 L;εTNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.04 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,15 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

 

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