注 意:正式測定前務(wù)必取 3 - 5 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨;衔锷系γ-谷氨;D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,產(chǎn)生谷氨酸鹽,在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。
測定原理:
γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸,生成對硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通過測定405nm光吸收增加速率,來計算γ-GT酶活性。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體14.8mL×1瓶,4℃保存。
工作液(在試劑二瓶中配制):臨用前配制,把試劑三倒入試劑二瓶中,充分溶解(室溫過低時可以40℃水浴促進(jìn)溶解);然后把試劑四倒入試劑二瓶中,混勻后室溫保存。
粗酶液提取:
組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心15min,取上清,置冰上待測。
細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心15min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
γ-GT測定操作:
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到405 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中預(yù)熱30min(保證無沉淀)。
3. 測定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,依次加入20μL上清液,180μL工作液,混勻后于405nm測定10s和70s時吸光度,記為A1和A2。
γ-GT活性計算:
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.006x+0.0016,x為對硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/g 鮮重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T
= 1.67 × [ (A2-A1)-0.0016]
V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間(min),1min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.003x+0.0016,x為對硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=3.34× [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/g 鮮重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。
γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T
= 3.34 × [ (A2-A1)-0.0016]
V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量,g;V樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間(min),1min。