注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
DHAR存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsA和GSSG，調(diào)控細(xì)胞AsA/DHA比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，進(jìn)而提高植物食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。
測(cè)定原理：
DHAR催化GSH還原DHA生成AsA，通過(guò)測(cè)定DHA減少速率，計(jì)算DHAR活性。
實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：
研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體35 mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。
粗酶液提�。�
1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g 4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
DHAR測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL試劑三、100μL試劑四和700μL 試劑二，最后加100μL上清液，迅速混勻后于265nm比色，記錄30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。
DHAR活性計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T
= 92×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
DHAR(nmol/min/g鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 92×△A ÷W
(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 92×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T
= 92×△A
ε ：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol /cm；109：摩爾分子換算成納摩爾分子；d：比色杯光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min。
