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多胺氧化酶(PAO)測劑盒

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     意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:                           

多胺氧化酶是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶,通過調(diào)節(jié)體內(nèi)多胺水平和生成物的濃度,參與各種植物體對逆境脅迫的反應(yīng)和生長發(fā)育過程。

 

測定原理:

PAO催化多胺氧化產(chǎn)生過氧化氫,在過氧化氫酶存在的條件下與底物顯色,在550nm下有特征吸收峰,通過測定吸光值增加速率來反映PAO活性。

需自備的儀器和用品:

分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體6mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:液體3mL×1瓶,4℃保存;

試劑四:液體3mL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測。

細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

血清等液體:直接測定。

 

測定步驟:

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

試劑名稱(µL

測定管

試劑一

700

試劑二

100

試劑三

50

樣本

100

試劑四

50

迅速混勻,于550nm下測定初始吸光值A130min后吸光值A2。ΔA=A2-A1。

 

PAO活性計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。

PAOU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.002÷T =166.67×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。

PAOU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.002÷T =166.67×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。

PAOU/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.002÷T =0.333×ΔA

(4)按液體體積計算

單位的定義:每mL液體樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。

PAOU/mL=ΔA×V反總÷V÷0.002÷T =166.67×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

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