注 意： 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
GOGAT分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同構(gòu)成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。
測(cè)定原理：
GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時(shí)NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：在試劑二中加入25mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后3h內(nèi)用完）；
（2）取0.1mL樣本和0.9mL工作液于1mL比色皿中，混勻，加工作液的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在340 nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和5分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
GOGAT活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GOGAT（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V×樣Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GOGAT（nmol /min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GOGAT（nmol /min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.642×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
