注 意: 正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶,廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
測定原理:
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少,即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品:
天平、研缽、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機(jī)、1mL玻璃比色皿。
試劑的組成和配制:
提取液:液體80mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體10mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體12mL×1瓶,4℃保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑五:液體25mL×1瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作表:
| 空白管 | 對照管 | 測定管 |
樣本(μL) |
| 100 | 100 |
蒸餾水(μL) | 100 | 200 |
|
試劑一(μL) | 200 |
| 200 |
試劑二(μL) | 200 | 200 | 200 |
混勻后,25℃反應(yīng)1h | |||
試劑三(μL) | 200 | 200 | 200 |
充分震蕩30S | |||
上清液(μL) | 350 | 350 | 350 |
工作液(μL) | 700 | 700 | 700 |
充分混勻,蒸餾水調(diào)零,靜置3min后測定540nm處吸光值,分別記為A空白管、A對照管、A測定管?瞻坠苤灰鲆还,每個測定管需設(shè)一個對照管。 |
計算公式:
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。
1.按照蛋白含量計算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /mg prot)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷(V樣×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義:每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷(W ×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算
酶活單位定義:每104個細(xì)胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /104 cell)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標(biāo)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷細(xì)胞數(shù)量
V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.2mL;V樣:體系中加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g