本試劑采用穩(wěn)定高效的RT-PCR預(yù)混體系,是以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR的專用試劑。其原理為用基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得第一鏈cDNA(不可使用Oligo(dT)或Random Rimer合成第一鏈cDNA),再使用基因特異性正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部過程。反應(yīng)體系中已含有電泳所需的指試劑(藍(lán)色和黃色),反應(yīng)后可以直接進(jìn)行電泳。 在本試劑中,將耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成50×One-Step Enzyme Mix預(yù)混液;反應(yīng)Buffer、dNTP以及電泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此使得操作更加簡(jiǎn)單便,擴(kuò)增產(chǎn)物可用于平端克隆和DNA測(cè)序。 | |||||||||||||||||
組分 | |||||||||||||||||
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注意:1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高,第一次使用之前要離心收集至反應(yīng)管底部,吸取時(shí)應(yīng)緩慢小心。 2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶,反應(yīng)配制可在常溫進(jìn)行,但各組分應(yīng)-20°C保存。 | |||||||||||||||||
主要特征 | |||||||||||||||||
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儲(chǔ)存 | |||||||||||||||||
請(qǐng)置于-20°C,可保存2年;避免反復(fù)凍融。 | |||||||||||||||||
實(shí)例 | |||||||||||||||||
1.以Hela細(xì)胞總RNA為模板,使用HiFi One Step RT PCR Mix擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目的片段。電泳結(jié)果顯示,166bp~4128bp 的 DNA 片段都得到了良好的擴(kuò)增。 | |||||||||||||||||
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M:D10000 DNA Marker,1-7分別為:β-actin(166bp)、GAPDH (552bp)、GAPDH(960bp)、BMP2 (1574bp)、PRKN (1705bp)、TFRC (2755bp)和TFRC( 4128bp)。 | |||||||||||||||||
2. 以Hela細(xì)胞總RNA為模板,使用不同的RNA模板量(1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg)進(jìn)行HiFi One Step RT PCR Mix擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示,三種不同長(zhǎng)度的片段都獲得良好的擴(kuò)增,過多的模板可能會(huì)抑制擴(kuò)增。 | |||||||||||||||||
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M:D10000 DNA Marker,1-9分別為1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg的 RNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。 |