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一步法sgRNA 合成試劑盒

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CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù),也是細菌和古細菌為應(yīng)對噬菌體和外源質(zhì)粒的攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。此系統(tǒng)的工作原理是通過人工優(yōu)化的具有引導(dǎo)作用的sgRNA(Single Guide RNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對的靶位點處剪切雙鏈DNA,引起DNA斷裂,進而利用生物體內(nèi)非同源末端修復(fù)機制或同源重組機制修復(fù)DNA,導(dǎo)致基因移碼突變、替換或刪除,致使基因功能喪失。
    sgRNA的體外合成通常有兩種策略:一種為構(gòu)建含特異性序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒,另一種則使用合成的oligo退火延伸生成含T7轉(zhuǎn)錄啟動子的雙鏈DNA分子,進而再使用T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄,從而獲得sgRNA。利用合成的Oligo直接制備sgRNA,具有操作簡單快速、可實現(xiàn)高通量等優(yōu)勢,已經(jīng)成為體外合成sgRNA的首選方案。Cas9的切割是通過向?qū)NA(gRNA)與靶DNA形成約20bp堿基的配對,且靶序列的3’端需要有PAM結(jié)構(gòu)(NGG),再引導(dǎo)Cas9作用實現(xiàn)的。本試劑盒可通過一步反應(yīng)獲得高純度、高產(chǎn)量的sgRNA,僅需要合成一條含有特定靶標(biāo)序列的Oligo,可最短在4h內(nèi)獲得50~80 μg的sgRNA。

組份

名稱 25T
2×sgRNA Reaction Mix 250 μl
sgRNA Enzyme Mix 50 μl
Anti sgRNA Oligo(5 μM) 50 μl
RNase Free DNase I(2U/μl) 50 μl
Positive Sense-sgRNA Oligo(5 μM) 20 μl
10xRD Buffer 100 μl
RNase Free H2O 1 ml
注意:Positive Sense sgRNA Oligo為陽性對照品,在實驗時可用于質(zhì)控反應(yīng)體系。

原理

sgRNA體外合成

儲存

-20℃可保存2年,避免反復(fù)凍融。

實例

sgRNA體外合成
Fig. 一步法sgRNA合成試劑盒獲得的sgRNA,分別為37℃孵育30min、1h、2h、8h和過夜孵育的sgRNA,孵育時間越長,sgRNA產(chǎn)量越高。
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