使用說(shuō)明：
1.樣品的準(zhǔn)備。
取適量待測(cè)定的抑制劑樣品，用Assay Buffer或DMSO等適當(dāng)?shù)娜軇┡渲瞥蛇m宜濃度的溶液，如果有必要可配制成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻却谩?/span>
2.陽(yáng)性對(duì)照的準(zhǔn)備。
本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照抑制劑Ebselen濃度為10mM，配制在DMSO中，可以根據(jù)需要使用與待測(cè)抑制劑一樣的溶劑稀釋成所需濃度或濃度梯度。通常Ebselen的IC50約為0.5μM-2μM，使用本試劑盒時(shí)Ebselen的抑制效果參考圖2。
3.樣品測(cè)定。
a.根據(jù)樣品數(shù)量(含相關(guān)對(duì)照)，參考下表配制適量的Assay Reagent。注：由于2019-nCoV Mpro/3CLpro的甘油含量較高，微量吸取時(shí)要注意避免吸頭吸附損失并吹打完全，加入2019-nCoV Mpro/3CLpro后需要注意充分混勻。
| 1個(gè)樣品 | 5個(gè)樣品 | 10個(gè)樣品 | 20個(gè)樣品 | |
| Assay Buffer | 92μl | 460μl | 920μl | 1.84ml |
| 2019-nCoV Mpro/3CLpro | 1μl | 5μl | 10μl | 20μl |
b.參考下表，使用96孔黑板設(shè)置各組別，并按照下表依次加入檢測(cè)試劑和樣品。加入待測(cè)樣品后，混勻。為獲得更加可靠的檢測(cè)結(jié)果，建議每個(gè)樣品至少應(yīng)該進(jìn)行2個(gè)重復(fù)孔的檢測(cè)。
| 空白對(duì)照 | 100%酶活性對(duì)照 | 陽(yáng)性抑制劑對(duì)照 | 樣品 | |
| Assay Buffer | 93μl | - | - | - |
| Assay Reagent | - | 93μl | 93μl | 93μl |
| Ebselen溶液 | - | - | 5μl | - |
| 樣品溶劑 | 5μl | 5μl | - | - |
| 待測(cè)樣品 | - | - | - | 5μl |
注：樣品溶劑是指配制和稀釋待測(cè)抑制劑所用的溶劑。
c.各孔快速加入Substrate 2μl，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會(huì)立即開(kāi)始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時(shí)間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
d.37℃避光孵育5分鐘后信號(hào)即趨于穩(wěn)定，可在5-20分鐘內(nèi)使用多功能酶標(biāo)進(jìn)行熒光測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為340nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490nm。當(dāng)熒光讀數(shù)偏低時(shí)，也可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至20-30分鐘。
注：也可在步驟a中將待測(cè)樣品加入后37℃孵育10分鐘，再將Substrate加入反應(yīng)體系中。37℃孵育10分鐘再加入Substrate可能會(huì)降低抑制劑的IC50。建議通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定未知抑制劑比較適合的孵育時(shí)間。
4.計(jì)算:
a.計(jì)算每個(gè)樣品孔和空白對(duì)照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對(duì)照、RFU100%酶活性對(duì)照、RFU陽(yáng)性對(duì)照和RFU樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。
b.計(jì)算每個(gè)樣品的抑制百分率。計(jì)算公式如下：
抑制率(%) = (RFU100%酶活性對(duì)照 - RFU樣品) / (RFU100%酶活性對(duì)照 - RFU空白對(duì)照) × 100%
c.對(duì)于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有效的抑制劑，通過(guò)檢測(cè)該抑制劑的劑量效應(yīng)就可以計(jì)算出該抑制劑的IC50。使用本試劑盒檢測(cè)Ebselen對(duì)于Mpro/3CLpro的抑制作用的檢測(cè)結(jié)果參考圖2，Substrate直接加入反應(yīng)體系中，然后孵育10分鐘進(jìn)行熒光測(cè)定，IC50約為0.8μM。
圖2. 新型冠狀病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制劑篩選試劑盒檢測(cè)Ebselen的效果圖。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)因樣品和檢測(cè)條件等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
