實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中指標水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,與HRP標記的抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算濃度。
試劑盒組成
1 | 30倍濃縮洗滌液 | 20ml×1瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 標準品 | 0.5ml×1瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12孔×8條 | 9 | 標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1瓶 | 10 | 說明書 | 1份 |
5 | 顯色劑A液 | 6ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2張 |
6 | 顯色劑B液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1個 |
操作步驟
1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可在小試管中進行稀釋。
2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。