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R5421 Chemically Competent Cell

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 R5421 Competent Cell:                                       100μl/支               保存: -80℃(3個月)

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存:-80℃(12個月)

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存:-20℃(12個月)

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12個月)

基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64

R5421 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品說明

R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株,在文獻中也稱為CY162,MATα型,多用于K+/鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白的鑒定試驗中,也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗。Transformation marker為:ura3,leu2,該菌株可以在含有100mM KCl的培養(yǎng)基中國正常生長,在含有5-10mM KCl的培養(yǎng)基中生長緩慢,當(dāng)培養(yǎng)基中KCl濃度低于0.5mM,R5421(CY162)細(xì)胞停止生長。R5421感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10cfu/μg DNA。

操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài),步驟如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min,再次放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min以上。

2. 取100 µl冰上融化的R5421感受態(tài)細(xì)胞,依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒0.5-3 µg,Carrier DNA10 µl,PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻,30℃水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 µl 重懸,離心 30s棄上清。

5. ddH2O 50 µl重懸,涂板,29℃培養(yǎng)48-96 h。

注意事項

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?上鄳(yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。

4. R5421酵母菌株對高溫敏感,適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染,是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克。煌縎D單缺平板29℃,48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。

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