注   意 ：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧， 在合成 ATP 的同時，形成大量的 ROS，同時NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和 TCA 循環(huán)的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對細胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。  

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH，NADH 通過 PMS 的遞氫作用，還原

氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測吸光值；而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用 MTT 還原法檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 4 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時加入 4mL 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入 4mL 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑五：液體 1.8mL×1 支，4 ℃保存；

試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NAD+和 NADH 的提取：

1血清（漿）中 NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10  的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提�。喊凑昭�清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2組織中 NAD+和 NADH 的提�。�

NAD+的提�。喊凑战M織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提�。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和， 混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3細胞或細菌中 NAD+和 NADH 的提�。�

NAD+的提�。合仁占�細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 酸性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min

（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。NADH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（104  個）：堿性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 堿性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min

（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置 5min 后，20000g，25℃離心 5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，570nm 下比色，讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測定中△A（A2-A1）≤0.0222，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒 50 管保證測 24 個NAD+或 NADH.。

NAD+和 NADH 含量的計算：

（一） NAD+含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.295x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 為△A，x 為 NAD+濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NAD+含量計算

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=67.8×( △A -0.0302）

2、組織、細菌或細胞中 NAD+含量計算(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)= 6.8×( △A -0.0302）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.014×( △A -0.0302）

（二）NADH 含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.2808x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 為△A，x 為 NADH 濃度 nmol/mL

1、血清（漿）中NADH 含量計算

NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 71.2×( △A -0.0222）

2、組織、細菌或細胞中 NADH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)= 3.6×( △A -0.0222）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 7.1×( △A -0.0222）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0222）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿） 體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)， 500 萬。

注意：

最低檢測限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot