注意:正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 50mL×1 瓶,-20℃保存; 試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 0.6mL×1 支,-20℃保存; 試劑三:液體 40mL×1 瓶,4℃保存;
試劑四:粉劑×2 支,4℃保存,臨用前加入 1mL 雙蒸水,用不完的試劑仍 4℃保存;
試劑五:粉劑×2 支,-20℃保存,臨用前加入 500µL 雙蒸水,用不完的試劑仍-20℃保存; 試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存,臨用前加入 1.5mL 雙蒸水,用不完的試劑仍-20℃保存;
產(chǎn)品說(shuō)明:
CS(EC 2.3.3.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶,是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸;該反應(yīng)促使無(wú)色的DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色的 TNB,在 412nm 處有特征吸光值。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本前處理
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞,加入 1mL 提取液和 10µL 試劑二,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
將勻漿液 600g,4℃離心 5min。
將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 CS。
在沉淀中加入 200µL 試劑一和 2µL 試劑二,反復(fù)吹打充分混勻,用于 CS 測(cè)定。檸檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。
二、測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm,蒸餾水調(diào)零。
2、試劑三置于 25℃(一般物種)或者 37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中預(yù)熱 10min 左右(保證無(wú)沉淀)。
3、操作表:
在微量玻璃比色皿/96 孔板中分別加入
試劑名稱(chēng)(µL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
試劑三 | 172 | 186 |
試劑四 | 7 | 7 |
試劑五 | 7 | - |
樣本 | 7 | 7 |
試劑六 | 7 | - |
加試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),記錄 412nm 波長(zhǎng)下 10 秒時(shí)的初始吸光度 A1,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 2 分鐘(96 孔板放入恒溫箱中);迅速取出比色皿并擦干,412 nm 下記錄 2 分 10 秒時(shí)的吸光度 A2,上清液、沉淀的測(cè)定管、對(duì)照管均需測(cè)量(每個(gè)樣本需測(cè) 4 管)。
計(jì)算上清液的測(cè)定管∆A1=A2-A1,上清液對(duì)照管的∆A1’=A2-A1,沉淀的測(cè)定管∆A2=A2-A1, 沉淀的對(duì)照管∆A2’=A2-A1,計(jì)算∆A 上清=∆A1-∆A1’,計(jì)算∆A 沉淀=∆A2-∆A2’。
三、CS 活性計(jì)算:
1、按微量玻璃比色皿計(jì)算:
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:37℃或 25℃下每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CS 上清(U/mg prot)=∆A 上清÷(ε×d)×V 反總÷(Cpr 上清×V 樣本)÷T
=1050×∆A 上清÷Cpr 上清
CS 沉淀(U/mg prot)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V 反總÷(Cpr 沉淀×V 樣本)÷T
=1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀
CS(U/mg prot)=CS 上清+CS 沉淀=1050×∆A 上清÷Cpr 上清+1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:37℃或 25℃下每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CS 上清(U/g 鮮重)=∆A 上清÷(ε×d)×V 反總÷(W×V 樣本÷V 提。÷T =1061×∆A 上清÷W CS 沉淀(U/g 鮮重)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V 反總÷(W×V 樣本÷V 沉淀)÷T =212×∆A 沉淀÷W CS(U/g 鮮重)=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A 上清÷W+212×∆A 上清÷W。
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:37℃或 25℃下每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CS 上清(U/104 cell)=∆A 上清÷(ε×d)×V 反總÷(500×V 樣本÷V 提。÷T=2.1×∆A 上清CS 沉淀(U/104 cell)=∆A 沉淀÷(ε×d)×V 反總÷(500×V 樣本÷V 沉淀)÷T =0.42×∆A 沉淀CS(U/104 cell)=CS 上清+CS 沉淀=2.1×∆A 上清+0.42×∆A 沉淀。
ε:TNB 的消光系數(shù),13.6×10-3mL/(nmol·cm);V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.2 mL;d:比色皿光徑,1cm;V 樣本:加入的樣本體積,0.007mL;V 提。禾崛∫后w積,1.01mL;V 沉淀:溶解沉淀的總體積,0.202mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2min;Cpr 上清:上清液的蛋白濃度,mg/mL;Cpr 沉淀:
沉淀溶解后的蛋白濃度, mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)胞數(shù)量/細(xì)菌,500 萬(wàn)。
3、按 96 孔板計(jì)算:將上述公式中的 d=1cm 改為 d=0.6cm(96 孔板光徑)進(jìn)行計(jì)算即可。
注意事項(xiàng):
1、測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置,以免變性和失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持 37℃或 25℃,取小燒杯一只裝入一定量的 37℃或 25℃蒸餾水, 將此燒杯放入 37℃或 25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、用 96 孔板測(cè)定時(shí),根據(jù)測(cè)定管數(shù)量配制測(cè)定管工作液(試劑三、四、五、六)和對(duì)照管工作液
(試劑三、四),因通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化計(jì)算酶活,不推薦同時(shí)測(cè)多個(gè)樣本。