測定意義:
蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸:甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中,Cys是唯一一種含有巰基的含硫氨基酸,從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來,并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化。Cys參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成,經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分,還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外,Cys大量積聚在皮膚和粘膜表面,在角蛋白生成中維持重要的琉基酶的活性,并且補充硫基,以維持皮膚的正常代謝,調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過敏性皮膚等作用。
測定原理:
半胱氨酸與磷鎢酸反應(yīng),可將磷鎢酸還原成鎢藍,在600nm處有吸收峰,通過測定鎢藍的生成量,即可計算出半胱氨酸含量。
自備儀器和用品:
酶標儀、低溫離心機、可調(diào)式移液槍、酶標板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體×1瓶,4℃保存。
標準品:液體×1支,1μmol/mL半胱氨酸標準液,4℃保存。
樣品中半胱氨酸提。
1. 液體樣品:取50μL液體樣品,加試劑一450μL,充分混勻,11000 rpm 4℃離心10min,取上清液,即待測液。
2. 組織樣品:稱取約50mg組織,加入500μL試劑一,冰上充分研磨,11000 rpm 4℃離心10 min,取上清液,即待測液。
測定:
1. 酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到600 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白孔:取酶標板,在空白孔中加入20μL蒸餾水,90 μL試劑二,90 μL試劑三,室溫靜置15min,于600 nm測定光吸收,記為A空白。
3. 標準孔:取酶標板,在空白孔中加入20μL標準品,90 μL試劑二,90 μL試劑三,室溫靜置15min,于600 nm測定光吸收,記為A標準。
4. 測定孔:取酶標板,在空白孔中加入20μL待測液,90 μL試劑二,90 μL試劑三,室溫靜置15min,于600 nm測定光吸收,記為A測定。
半胱氨酸含量計算:
1. 按液體樣品的體積計算:
半胱氨酸含量(μ mol/mL)
=C標準×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白)×(500μL÷20μL)×(1mL÷50 μL)
=500×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白)
C標準:標準品濃度,1μmol/mL;V標準:加入標準品體積(mL),20μL=0.02 mL。
2. 按鮮重計算:
半胱氨酸含量(μ mol/g FW)
= C標準×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白)×(500μL÷20μL)÷W
=25×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白) ÷W
W:組織樣品質(zhì)量(g)。