注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
AKP是指在堿性條件下催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的酶類,屬于絲氨酸蛋白酶。此外,該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵,具有轉酯及轉肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一,廣泛應用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。
測定原理:
在堿性條件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸生成鎢藍;鎢藍在680nm有特征吸收峰,測定680nm吸光度增加速率,來計算AKP活性。
自備儀器和用品:
可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體90mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加入20 mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。(可在燒杯上蓋一層保鮮膜,注意觀察,避免水分全部蒸發(fā),一般加熱15-30分鐘,該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用)。
試劑四:粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。
試劑五:液體10mL×1瓶,4℃保存。
標準品:液體1mL×1支,0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提。
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。
2. 血清或培養(yǎng)液:直接測定。
3. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作:
1. 分光光度計預熱30min,調(diào)節(jié)波長到680 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二、試劑三和試劑四置于40℃水浴保溫30min。
3. 對照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液(血清或培養(yǎng)液),200μL試劑二,混勻后置于40℃水浴保溫10min;加入200μL試劑三,混勻后8000g ,4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A對照管。
4. 測定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液(血清或培養(yǎng)液),200μL試劑三,混勻后置于40℃水浴保
溫10min;加入200μL試劑二,混勻后8000g ,4℃離心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與對照管不同,先加試劑三,后加試劑二)
5. 空白管:取一支EP管,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑四200μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A空白管。
6.標準管:取EP管,加入200μL標準品,1000μL試劑四,200μL試劑五,混勻后置于40℃水浴保溫20min,于680nm測定光吸收,記為A標準管。
注意:空白管和標準管只需要測定一次。
計算公式:
1. 按照樣本蛋白濃度計算
AKP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
AKP活性(nmol/min /mg prot)= C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計算
AKP活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。
AKP活性(nmol/min /g鮮重)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W
3. 按照液體體積計算
AKP活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
AKP活性(nmol/min/mL)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總÷V1÷T= 125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)
4. 按照細胞數(shù)量計算
AKP活性單位定義:30℃每104個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
AKP活性(nmol/min /104 cell)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V反總÷(細胞數(shù)量×V1÷V2)÷T= 125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷細胞數(shù)量
C標準品:0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液;V反總:酶促反應總體積,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),0.1 mL;V2:提取液總體積(mL),1mL;T:催化反應時間(min),10min;W:樣品質(zhì)量(g)。
注意事項:
臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。