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胰蛋白酶測(cè)試盒分光光度法

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     意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:                           

胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈,是一種重要的消化酶。此外,胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。

 

測(cè)定原理:

胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵,釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng),導(dǎo)致溶液的pH值降低,以苯酚紅為指示劑,測(cè)定溶液在555nm處吸收值的變化,可以快速測(cè)得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系。

自備儀器和用品:

紫外可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體60 mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體10 mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體4 mL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)冰浴勻漿,10000g,4離心10min,取上清,即粗酶液。

 

測(cè)定步驟:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到555 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 工作液的配制:臨用前根據(jù)用量按照試劑一(V):試劑二(V):蒸餾水(V):試劑三(V=1 mL1 mL5.4 mL0.4 mL的比例充分混合。注意:現(xiàn)用現(xiàn)配,用多少配多少,在空瓶中配制,試劑盒中帶有4個(gè)空瓶)

3. 吸取25μL樣本,加入975 μL工作液,混勻后立即測(cè)定,記錄555nm1min時(shí)的吸光值A12min時(shí)的吸光值A2。計(jì)算A=A1-A2

 意:如果A小于0.005,可將反應(yīng)時(shí)間延長到5min。如果A大于0.5,體系迅速變色,可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定(建議稀釋10倍),計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

胰蛋白酶活性計(jì)算公式:

使用石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

 

活性單位定義:室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少11個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶(U/mg prot= A ×V反總 ÷Cpr×V1÷T

=40×A ÷Cpr

 

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:室溫每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少11個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶(U/g 鮮重= V反總÷W×V1÷V2÷T

=40×A ÷W

Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定;W:組織質(zhì)量(g);V1:加入反應(yīng)體系中粗酶液體積(mL),25 μL=0.025 mL;V2:粗酶液總體積(mL),1 mL;V反總:反應(yīng)總體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),1 min。

 

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