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羊痘病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

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 【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:羊痘病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

英文名稱: Capri Pox Virus Detection Kit ( Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測綿羊痘/山羊痘病毒,對綿羊痘/山羊痘病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【原    理】

本試劑盒針對綿羊痘/山羊痘病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含綿羊痘/山羊痘病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

羊痘病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)組成】

序號

組成

50T/盒

1

CaPV  PCR反應(yīng)液

1000 μL×1管

2

CaPV 陽性對照

40 μL×1管

3

CaPV 陰性對照

40 μL×1管

4

說明書

1份

注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為綿羊痘/山羊痘靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應(yīng)避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應(yīng)凍存于-80℃以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

2)核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應(yīng)液UNG酶及Taq酶)

20 μL

3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集 CaPV 熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

37℃:2分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

PCR擴增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。 

2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定:

1)陽性:標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標本檢測結(jié)果解釋

FAM

+

標本中檢出CaPV

-

標本中檢出CaPV

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤3%。

羊痘病毒熒光PCR檢測試劑盒(實時熒光PCR法)注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理;

3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染;檢測結(jié)束后,應(yīng)立即對工作臺清潔;

4. 吸取反應(yīng)液時,應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡; PCR 儀前,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確;

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放;

7. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記

8. 檢測過程中使用過的吸頭,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄;工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒;

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用并在有效期內(nèi)使用。

 

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