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恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(飼料專用)

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  1 原理及用途

恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(飼料專用)采用間接競爭ELISA方法檢測飼料樣本中的恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的恩諾沙星和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含恩諾沙星含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中恩諾沙星的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,45min15min

2.3 檢測下限:

飼料……………………………………8ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

恩諾沙星………………………………100%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

沙拉沙星………………………………2%

 2.5 樣本回收率:

飼料……………………………………85%±15%

恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(飼料專用)恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(飼料專用)組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):1ppm …………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)……………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋)…………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

5×復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:無水乙腈、正己烷、濃HCl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:0.15M鹽酸溶液

    5ml濃鹽酸,加入去離子水混勻,定容至400ml。

配液2:樣本提取液

    量取10ml 0.15M鹽酸溶液(配液1)加入到90ml無水乙腈中混合均勻。

配液3:復(fù)溶液

5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋(1份復(fù)溶液加4份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液4:工作洗滌液

    濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 飼料處理方法

1)稱取1.0±0.05g 粉碎后飼料樣本于50ml離心管中;

2)加入8ml樣本提取液(配液2),振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;

3)取2ml清澈上層有機(jī)相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中,50-60℃水浴氮氣吹干;

4)加入2ml正己烷,振蕩30s,再加2ml復(fù)溶液(配液3),振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘;

5)去除上層正己烷,取最下層清澈水相50µl于1.5ml離心管中,再加入450ul復(fù)溶液(配液3),振蕩混勻30s,取50ul分析。

樣本稀釋倍數(shù):80    檢測下限:8ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3    滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘若藍(lán)色過淺,可適當(dāng)延長反應(yīng)時間

6.5     止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

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