1 原理及用途
硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、蜂蜜等樣本中的硝基咪唑類(Nitiomidazoles,NMZ),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的硝基咪唑類和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗硝基咪唑類抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含硝基咪唑類含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中硝基咪唑類的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:1.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:25℃ 30min~30min~15min
2.3 檢測(cè)下限:
組織(雞肉、鴨肉、肝臟、魚、蝦等)………1.5ppb
蜂蜜、牛奶………………………………………1.5ppb
雞蛋………………………………………………3ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
與類似物的交叉反應(yīng)率:
甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%
二甲硝咪唑DMZ……………………………………68%
洛硝唑(RNZ) ………………………………………112%
異丙硝唑……………………………………………33%
2.5 樣本回收率:
魚/蝦/禽/肝臟…………………………………90±10%
蜂蜜、牛奶、雞蛋……………………………90±10%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液(黑蓋):各1ml
0ppb、1.5ppb、3.0ppb、6.0ppb、12.0ppb、24.0ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液:100ppb……………………1ml
抗體工作液 (藍(lán)蓋) ………………………………5.5ml
酶標(biāo)記物 (紅蓋) …………………………………11ml
底物液A (白蓋)……………………………………6ml
底物液B(黑蓋) ……………………………………6ml
終止液(黃蓋) ………………………………………6ml
20×濃縮洗滌液(白蓋)……………………………40ml
2×濃縮復(fù)溶液(黃蓋) ……………………………50ml
說(shuō)明書………………………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、恒溫箱
4.2 微量移液器:?jiǎn)蔚?0µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑:無(wú)水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:0.1M CB緩沖液
稱取4.66g無(wú)水碳酸鈉,0.5g碳酸氫鈉去離子水混勻溶解,定容至500ml(pH=10.6)。
配液2:復(fù)溶液
將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋(1份復(fù)溶液加1份去離子水),用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液3:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟:
5.3.1蜂蜜、組織(雞肉、鴨肉、肝臟、魚、蝦等)
1)取3g樣本,加3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至均勻或全部溶解;
2)加入9ml 乙酸乙酯,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘;
3)取3ml清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中,55~60℃氮?dú)?/span>或空氣吹干;
4)加入正己烷1ml,振蕩30s,再加入0.5ml復(fù)溶液振蕩30秒,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5分鐘;
5)去除上層有機(jī)相,取下層100µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):0.5 檢測(cè)下限:1.5ppb
5.3.2 雞蛋
1)取3g均質(zhì)后的雞蛋樣本放入50ml離心管中,加入9ml乙酸乙酯,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上10分鐘;
2)取3ml清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中,55~60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
3)加入正己烷2ml,振蕩5分鐘,再加入1ml復(fù)溶液,振蕩5分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層100µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:3ppb
5.3.3 牛奶
1)取3ml均質(zhì)后的牛奶樣本放入50ml離心管中,加入9ml乙酸乙酯,振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上5分鐘;
2)取3ml清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中,55~60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
3)加入正己烷2ml,振蕩30s,再加入1ml復(fù)溶液,振蕩2分鐘,室溫4000轉(zhuǎn)/分以上,離心5分鐘;
4)去除上層有機(jī)相,取下層100µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:1.5ppb
6 硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
6.1 編 號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本100µl/孔到各自的微孔中,然后加抗體工作液50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 加酶反應(yīng):加酶標(biāo)記物100µl/孔,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗 滌:同上
6.6 顯 色:加底物液A 50µl/孔,再加底物液B 50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。
6.7 終 止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.8 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。
8 硝基咪唑類酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。