1 原理及用途

甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒采用競爭ELISA方法檢測組織、飼料、尿樣和血清等樣本中的甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP），試劑盒由預(yù)包被甲氧芐氨嘧啶抗體的酶標板、TMP酶標記物、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的甲氧芐氨嘧啶和TMP酶標記物競爭酶標板上預(yù)包被的甲氧芐氨嘧啶抗體，用TMB底物顯色后，樣本吸光度值與樣本甲氧芐氨嘧啶含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中甲氧芐氨嘧啶的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：37℃，45min～15min

2.3 檢測下限：

飼料……………………………………1.6ppb

組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………0.4ppb

血清/尿液/血漿………………………0.3ppb

雞蛋……………………………………0.3ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

甲氧芐氨嘧啶………………………100%

磺胺吡啶……………………………<0.1%

磺胺…………………………………<0.1%

磺胺嘧啶……………………………<0.1%

磺胺異噁唑…………………………<0.1%

磺胺噻唑……………………………<0.1%

磺胺甲基嘧啶………………………<0.1%

磺胺多辛……………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

飼料……………………………………95%±15%

組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………95%±10%

血清/尿液/血漿………………………85%±10%

雞蛋……………………………………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.09ppb、0.27ppb、0.81ppb、2.43ppb

高標準液：100ppb……………………1ml

酶標抗原工作液（紅蓋）……………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

2×濃縮復(fù)溶液（黃蓋）……………50ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水甲醇、正己烷、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙腈

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

    將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液加1份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液2：0.1M 鹽酸溶液

    取濃鹽酸10ml加入去離子水混勻，定容至1200ml。

配液3：1M 氫氧化鈉溶液

稱取4g 氫氧化鈉加入去離子水混勻溶解，定容至100ml。

配液4：工作洗滌液

    將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 飼料處理方法 

1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml 0.1M鹽酸溶液（配液2），振蕩15min，室溫4000r/min離心10min；

2）取1ml上清到1.5ml離心管，加入70ul 1M氫氧化鈉溶液（配液3）調(diào)節(jié)PH值到6-8，混勻（針對不同的飼料樣本可以調(diào)節(jié)1M氫氧化鈉溶液的用量），室溫4000r/min離心10min；

3）取0.5ml上清到另一1.5ml離心管，加入0.5ml的復(fù)溶液（配液1），混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：1.6ppb

5.3.2 組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）處理方法 

1）取除去脂肪的勻漿組織2g±0.05g于50ml離心管中，加入6ml無水甲醇和2ml正己烷，最大速度渦旋振蕩5min；

2）室溫4000r/min離心10min，去除上層正己烷層，移取0.5ml下層清液到潔凈玻璃試管（避免觸碰脂肪層）；

3）在50-60℃下氮氣或空氣吹干；

4）加入400ul的復(fù)溶液（配液1）和500ul正己烷，最大速度渦旋振蕩1min；

5）轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫4000r/min離心5min，去除上層正己烷層，移取50ul下層清液進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 尿液/血清/血漿處理方法

1）取0.5ml樣本，室溫4000r/min離心5min；

2）取50µl上清液，加入450µl復(fù)溶液（配液1），混勻；

3）取50µl用于檢測。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.3ppb

（如果需要，可以加大 復(fù)溶液的用量來加大稀釋倍數(shù)）

5.3.4 雞蛋樣本處理方法

1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取2g±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min離心5min；

3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶液（配液1），用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；

5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限：0.3ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標抗原工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，37℃反應(yīng)45min。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15min（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。