AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞
AH109 Chemically Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格:10×100μl
保存條件: -80℃
AH109
10×100μl
保存條件: -80℃
Carrier DNA
5ug/μl;100 μl
保存條件 -20℃
PEG/liAC
5 ml
保存條件: 4℃
基 因 型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,
MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
簡 要 說 明
AH109 菌株來源于 PJ69-2A 酵母菌株,將 lacZ 報(bào)告基因引入 PJ69-2A 誕生了 AH109,此菌株是 Clontech 公司開發(fā)
的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株,MATa 型,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì);蚺c MATα型酵母菌株 Y187 通過 mating 操作進(jìn)行蛋
白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)。Transformation marker 為: trp1, leu2,報(bào)告基因?yàn)椋?/span>lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4
酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用:PGBKT7 和 PGADT7。質(zhì)粒 PGBKT7 的篩選標(biāo)志為 TRP1,用于表達(dá) DNA-BD(來
自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白;質(zhì)粒 PGADT7 的篩選標(biāo)志為 LEU,用于表
達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(
Prey)的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理:一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4
可分為功能上相互獨(dú)立的兩個結(jié)構(gòu)域:位于N 端1 ~ 174 位氨基酸區(qū)段的DNA 結(jié)合域(DNA-BD)和位于C 端768 ~881 位
氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS,并與之結(jié)合。而 AD
可以啟動 UAS 下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD 和 AD 單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄,但當(dāng)二者接近時,則呈現(xiàn)完整的 GAL4 活性,
使含有 UAS 的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下,BD 不與 AD 結(jié)合,將要檢測的蛋白質(zhì)分別與 BD 和 AD 融合,
形成 bait 融合蛋白(
bait -BD)和 prey 融合蛋白(
prey-AD),如果 bait 和 prey 發(fā)生相互作用,就會促使 BD 和 AD 的
相互接近,形成完整的 GAL4,從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109 有四個報(bào)告基因:lacZ, HIS3, ADE2, MEL1,分別由
三種不同的啟動子(GAL1,GAL2,MEL1)啟動,這三種啟動子只有 GAL4 識別的 17bp核心區(qū)相同,其余部分均不
同,大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。AngYuBio High5TM 系列 AH109 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,-80℃可保
存三個月,經(jīng) PGADT7 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。
操 作 說 明
1. 取一支無菌的 1.5ml EP 管,依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 1-3µg,Carrier DNA 10µl,100µl 冰上融化的 AH109 感受態(tài)細(xì)胞,PEG/LiAc 500µl,輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次;
2. 30℃水浴 30min,每 10min 輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次;
3. 每支加入 20µl 的二甲基亞砜;(用于提高轉(zhuǎn)化效率)
4. 42℃水浴 15min,每 5min 輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次;
5. 12000rpm 瞬時離心棄上清,每支加入 1ml 的 YPD Plus 于 30℃復(fù)蘇 1h;(用于提高轉(zhuǎn)化效率)
6. 12000rpm 瞬時離心棄上清,用 100µl 0.9% NaCl 重懸,涂板,30℃培養(yǎng) 48-96h。
注 意 事 項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化,PEG 溶液在低溫環(huán)境下會析出,請于常溫下完全溶解后使用。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?上鄳(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。
4. AHA109 酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為 27-30℃;高于 31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染,是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的 Adenine 被酵母消耗完
畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用,然而,有些菌株的 ADE2 基因被破壞,Adenine 合成途徑
受阻;又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物 P-ribosylamino imidazole(AIR)在細(xì)胞中積累而使
菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂 YPDA
平板 29℃,48h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆;涂 SD 單缺平板 29℃,48-60h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆,涂 SD 雙缺平
板 29℃,60-80h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆,涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃,80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。
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